3.1.2. Kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin
3.1.2.1. Định tính saponin trong dược liệu
– Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột dược liệu, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
– Sắc ký lớp mỏng
Dược liệu sử dụng: Cát cánh, Viễn chí, Mạch môn, Ngưu tất.
Lấy 2g bột dược liệu, thêm 10ml methanol, đun hồi lưu cách thủy 20 phút, lọc lấy dịch chiết, thủy phân dịch chiết bằng acid HCl 5% khoảng 1 giờ. Sau khi thủy phân chiết bằng 5ml CHCl3. Dịch chiết trên dùng chấm sắc ký.
Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm để chấm sắc ký.
Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH (19 : 1).
Sau khi khai triển sắc ký, quan sát các vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm, sau đó phun thuốc thử vanillin/acid sulfuric đặc.
Sau khi phun, sấy bản mỏng ở 1050C trong 5 phút, quan sát và ghi kết quả.
3.1.2.2. Xác định chỉ số phá huyết của bồ kết
* Định nghĩa chỉ số phá huyết (CSPH)
Chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có trong 1 gam nguyên liệu (dược liệu, bột saponin) để gây ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định.
* Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị các dung dịch cần thiết:
a) Dung dịch đệm: Dung dịch đệm phosphat
b) Dung dịch máu thỏ 2% đã loại fibrin
Cho vào bình định mức dung tích 50,0ml, 20ml dung dịch đệm, thêm chính xác 1,0ml dung dịch máu thỏ đã loại fibrin. Lắc nhẹ. Thêm dung dịch đệm vừa đủ 50,0ml.
c) Dung dịch bồ kết 0,02%
– Pha dung dịch bồ kết 1%
Cân chính xác 0,5g bột bồ kết đã tán nhỏ. Cho bột vào bình nón dung tích 100ml. Cho thêm 50ml dung dịch đệm vừa đun sôi. Lắc và đặt trên nồi cách thuỷ sôi. Đun sôi trong 30 phút. Lọc nóng qua bông vào trong cốc có mỏ. Để nguội. Chuyển dung dịch vào trong bình định mức 50,0ml. Tráng bình nón bằng dung dịch đệm và lọc qua lớp bông đã sử dụng. Thêm dung dịch đệm đến đủ 50,0ml. Lắc đều.
– Pha dung dịch bồ kết 0,02%
– Pha dung dịch bồ kết 0,02%
Hút chính xác 1,0ml dung dịch bồ kết 1% cho vào bình định mức dung tích 50,0ml. Thêm dung dịch đệm vừa đủ đến vạch. Lắc đều.
Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5ml), đánh số thứ tự từ 1 đến 20 và cho vào mỗi ống lần lượt các dung dịch theo bảng sau:
STT | DD đệm (ml) | DD bồ kết 0,04% (ml) | DD máu 2% đã loại fibrin (ml) |
1 | 0,95 | 0,05 | 1 |
2 | 0,90 | 0,10 | 1 |
3 | 0,85 | 0,15 | 1 |
4 | 0,80 | 0,20 | 1 |
5 | 0,75 | 0,25 | 1 |
6 | 0,70 | 0,30 | 1 |
7 | 0,65 | 0,35 | 1 |
8 | 0,60 | 0,40 | 1 |
9 | 0,55 | 0,45 | 1 |
10 | 0,50 | 0,50 | 1 |
11 | 0,45 | 0,55 | 1 |
12 | 0,40 | 0,60 | 1 |
13 | 0,35 | 0,65 | 1 |
14 | 0,30 | 0,70 | 1 |
15 | 0,25 | 0,75 | 1 |
16 | 0,20 | 0,80 | 1 |
17 | 0,15 | 0,85 | 1 |
18 | 0,10 | 0,90 | 1 |
19 | align="center" class="MsoNormal" style="margin-top: 6.0pt;text-align: center;text-indent: 14.2pt">0,05 | 0,95 | 1 |
20 | 0,00 | 1,00 | 1 |
Trộn đều dung dịch bằng cách bịt đầu ống nghiệm bằng ngón tay cái và dốc ngược dung dịch một cách nhẹ nhàng (làm tất cả với 20 ống nghiệm). Để yên 2 giờ.
Quan sát hiện tượng phá huyết:
Các ống nghiệm từ 1 – 20 sẽ có màu từ hồng nhạt đến hồng. Những ống có màu hồng, trong suốt, đáy ống không có tủa là có sự phá huyết hoàn toàn. Những ống còn hồng cầu ở đáy, lắc lên thấy đục là chưa được phá huyết hoàn toàn. Xác định ống gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn (là ống có màu hồng trong suốt nhưng ống trước đó vẫn còn hồng cầu lắng tủa).
Tính chỉ số phá huyết:
Chỉ số phá huyết được tính theo công thức sau:
C: nồng độ của dung dịch bồ kết
X: là số ml dung dịch bồ kết đã cho vào ống nghiệm mà ở ống đó có sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.