1. Chiết xuất artemisinin và acid artemisinic từ cây thanh hao hoa vàng
1.1. Đại cương về cây thanh hao hoa vàng
Chi Artemisia có trên 300 loài và thường được sử dụng làm gia vị, thuốc trừ sâu và là nguồn nguyên liệu sản xuất tinh dầu. A. vulgaris được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc làm thuốc điều trị đau dạ dày, nhức đầu, ỉa chảy, sốt, thấp khớp, viêm phổi… A. absinthium có chứa absinthe, một chất ma tuý có tác dụng gây ngủ và là một nguồn cung cấp tinh dầu sử dụng trong xoa bóp và đau dạ dày. A. annua, một cây sống hàng năm ở các vùng có khí hậu ôn hoà có hầu như trên khắp lãnh thổ của Trung quốc. ở Mỹ nó mọc hoang chủ yếu dọc theo các sông ở các bang New York, New Jersey, Maryland, Virginia, và Tây Virginia. Tuy nhiên, người ta cho rằng nó không có nguồn gốc ở Mỹ. Nó cũng mọc hoang ở Nam Tư cũ, Hungari, Bungari, Rumani, Italia, Pháp, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ, Arhentina và Liên Xô cũ.
Các nghiên cứu ở Trung Quốc, ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, Australia với mục đích nâng cao hàm lượng của artemisinin trong cây thanh hao hoa vàng. Mặc dù cây thanh hao hoa vàng mọc ở Trung Quốc được công bố có hàm lượng đến 0,9% nhưng nói chung cây thanh hao hoa vàng mọc ở nơi khác chỉ có khoảng 0,1% artemisinin. Hàm lượng artemisinin cao nhất trong phần lá ở phần ngọn (50 cm từ phần ngọn trở xuống) và ở thời điểm trước khi cây ra hoa. Vì artemisinin có trong cây với hàm lượng thấp nên người ta phát hiện các cây có hàm lượng cao và tìm cách nâng cao hàm lượng của nó trong cây. Ngoài ra người ta còn tìm cách tổng hợp nó, nhưng quá trình tổng hợp quá phức tạp và không có khả năng đưa vào ứng dụng. Tuy nhiên nếu ta sử dụng các hợp phần khác trong cây thanh hao hoa vàng làm nguyên liệu bán tổng hợp artemisinin thì có nhiều triển vọng.
1.2. Các thành phần hoá học khác trong cây thanh hao hoa vàng
Giá trị của artemisinin làm thuốc kháng sốt rét đã thúc đẩy nghiên cứu các thành phần khác có trong cây thanh hao hoa vàng. Artemisiten, được phát hiện lần đầu tiên nhờ HPLC-EC (Detector điện hoá) và sau đó được phân lập từ cây thanh hao hoa vàng với hiệu suất rất thấp. Sau đó nó được tổng hợp từ acid artemisinic. Hoạt tính chống sốt rét của nó in-vitro thấp hơn của artemisinin. Ngoài ra người ta còn chiết xuất từ cây THHV một loạt các hợp chất sesquiterpen và các hợp chất hữu cơ khác như acid artemisinic (Qinghao acid), Qinghaosu I (arteannuin A), Qinghaosu IV, Qinghaosu V (arteannuin E), Qinghaosu III (deoxyartemisinin), artemisinilacton (arteannuin F), artemisiten (dehydroartemisinin), methylether của acid artemisinic, arteannuin C, Qinghaosu II (arteannuin B), artemisinin G, epidesoxyarteannuin B, artemisinol, và acid epoxyartemisinic. Tất cả các sesquiterpen được phân lập ra từ cây THHV đều có sự liên hệ mật thiết với nhau và đều có cùng một đặc trưng là sự có mặt của bộ khung cis-decalin trong phân tử của chúng.
1.3. Chiết xuất artemisinin từ cây THHV
1.3.1. Cấu trúc và tính chất của artemisinin
Cấu trúc
Hiện nay cách đánh số theo Merck Index và Chemical Abstract thông dụng hơn. Artemisinin là một sesquiterpenlacton. Phân tử artemisinin có 15 nguyên tử carbon và 5 nguyên tử oxy tạo hệ thống 4 vòng liên hợp A, B, C, D.
Vòng A là vòng cyclohexan ở dạng ghế, vòng D là một delta-lacton và vòng B, C là dị vòng no chứa oxy.
Tính chất của artemisinin
Artemisinin là tinh thể hình kim không màu hoặc bột kết tinh trắng có điểm chảy 156-1570C (có tài liệu viết 153-1540C), năng suất quay cực 66,30 (C = 1.64, CHCl3). Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ ở 1745 cm–1(deltalacton) và ở 772, 831, 881, 1115 cm-1 (peroxyd). Artemisinin tan nhiều trong etanol, aceton, cloroform, ít tan trong n-hexan, benzen, toluen và hầu như không tan trong nước, nó dễ bị thủy phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ cao, tuy nhiên trong các dung môi không phân cực nó khá bền vững.
Artemisinin tinh khiết khá bền vững dưới tác dụng của nhiệt độ, nó không bị phân hủy ở nhiệt độ chảy của nó và cũng không biến đổi ở nhiệt độ cao hơn độ chảy của nó 500C trong vòng 5 phút, vì vậy có thể tinh chế bằng phương pháp thăng hoa. Artemisinin dễ bị phân hủy trong môi trường acid, kiềm.
1.3.2. Một số phương pháp được sử dụng chiết artemisinin và acid artemisinic
Mặc dầu artemisinin được phân lập đầu tiên ở Trung Quốc (có thể là Nam Tư cũ) nhưng công bố đầu tiên về phương pháp chiết artemisinin trong phòng thí nghiệm lại là của Klayman và các cộng sự. Lá cây thanh hao hoa vàng phơi khô được chiết với dung môi petrolether (30-600C). Dịch chiết được cô đặc và hoà tan lại trong cloroform, thêm acetonitril vào để kết tủa các hợp chất trơ trong cây như đường và sáp. Sắc ký dịch cô đặc trên cột silicagel triển khai bằng dung môi cloroform-ethylacetat. Theo dõi dung dịch giải hấp phụ của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng hơi iod. Phần dịch giải hấp thụ có hàm lượng artemisinin cao có thể kết tinh từ cyclohexan hoặc từ cồn 50%.
El Feraly và cộng sự đã mô tả kỹ thuật chiết tách artemisinin ở quy mô sản xuất như sau: Lá THHV khô được chiết bằng hexan. Chỉ sử dụng lá làm nguyên liệu chiết do thân và cành thanh hao mặc dù chiếm đến 80% trọng lượng của cây nhưng vì nó không có artemisinin hoặc nếu có thì với tỷ lệ rất thấp. Dịch chiết được phân bố giữa hai pha lỏng không đồng tan để cô đặc và loại bỏ các tạp chất. Giai đoạn trung gian này cải thiện hiệu quả của giai đoạn tách bằng sắc ký cột.
Việc phân bố dịch chiết hexan được được thực hiện bằng cách sử dụng hexan và acetonitril-nước. Cứ 1 g cặn sử dụng 12 ml hexan và và 4 ml acetonitril 20% nước. Kết quả của giai đoạn phân bố này là hầu như toàn bộ artemisinin chuyển sang pha acetonitril và lượng chất rắn chuyển sang pha acetonitril chỉ bằng 32-36% lượng cặn ban đầu. Nồng độ cao của artemisinin trong mẫu đưa vào sắc ký cột làm tăng khả năng tách và tăng hiệu quả làm việc của cột. Trước khi cất loại acetonitril cần loại bỏ nước. Loại bỏ nước có thể thực hiện bằng phương pháp thông thường như cất đẳng phí với benzen hoặc cồn tuyệt đối hoặc sử dụng natri sulfat khan. Có thể sử dụng một phương pháp đơn giản, hiệu quả và rẻ tiền để loại nước bằng cách làm bão hoà pha acetonitril nước bằng natri clorid, sau đó loại bỏ phần nước muối tách ra. Pha acetonitril được bốc hơi, thu được cặn dầu màu vàng nâu có tỷ lệ artemisinin giàu hơn 3 lần có trong dịch chiết. Vì pha acetonitril cũng giàu acid artemisinic nên có thể kết tinh một phần acid artemisinic. Do đó có thể loại đi 10% chất rắn trong pha acetonitril trước khi đưa vào sắc ký cột.
Sắc ký cột được thực hiện với tỷ lệ chất tan: chất hấp phụ = 1: 10 cho kết quả tốt nhất. Nếu không làm giai đoạn phân chia thì tỷ lệ này là 1: 44. Hỗn hợp dung môi chạy cột là hexan với tỷ lệ ethylacetat từ 10 đến 20%. Khi chạy sắc ký cột acid artemisinic sẽ bị rửa giải ra trước sau đó là artemisinin, nhưng do acid artemisinic đã bị loại ra phần lớn trước đó nên artemisinin thu được rất tinh khiết.
Quá trình sắc ký cột được thực hiện như sau:
Cột sắc ký được nạp bằng silicagel. Lượng silicagel nhồi cột phụ thuộc vào lượng hỗn hợp chứa artemisinin đưa vào tách, theo tỷ lệ hỗn hợp chứa artemisinin: silicagel = 1:10. Hỗn hợp chứa artemisinin được hoà tan tron aceton và luyện với một lượng silicagel (theo tỷ lệ hỗn hợp chứa artemisinin: silicagel = 1:1). Để cho bay hơi hết dung môi và nạp vào phần trên của cột.
Quá trình rửa giải artemisinin và acid artemisinic từ cột được thực hiện qua các giai đoạn sau:
1. Chạy SKC sử dụng hệ dung môi ethylacetat: hexan = 10:100 lượng dung dịch rửa giải rút ra bằng một thể tích cột (thể tích silicagel trong cột nhồi). Phần dung dịch rửa giải này chứa acid artemisinic).
2. Tiếp tục chạy SKC bằng hệ dung môi ethylacetat: hexan = 15:100 và thu lượng dung dịch rửa giải bằng 1 thể tích cột, trong đó phân đoạn đầu chứa acid artemisinic = 0,65 thể tích cột và phân đoạn sau chứa artemisinin = 0,35 thể tích cột.
3. Tiếp tục chạy SKC bằng hệ dung môi etyl acetat: hexan = 20:100 và rút ra 1,5 thể tích cột dung dịch rửa giải. Phần này có chứa artemisinin.
Bốc hơi dung môi các phân đoạn chứa acid artemisinic và artemisinin thu được acid artemisinic và artemisinin. Có thể kết tinh lại trong các dung môi khác nhau để thu được sản phẩm tinh khiết.
Cột có thể sử dụng được ít nhất 2 lần. Trước khi sử dụng lần tiếp theo cột được rửa bằng 1,5 thể tích ethylacetat. Khi sử dụng cột lần 2, hệ dung môi chạy phải được giảm độ phân cực,
cụ thể là giảm lượng ethylacetat xuống còn 8,13 và 18%. Hỗn hợp ethylacetat/hexan có thể sử dụng lại sau khi làm khan bằng Na2SO4và điều chỉnh thành phần của hỗn hợp. ở Việt Nam, ngay từ năm 1990 đã nghiên cứu chiết artemisinin. ở quy mô công nghiệp chúng ta không sử dụng petrol ether có độ sôi 300-600C để chiết do giá thành cao và petrol ether khó kiếm ở Việt Nam. Đa số các cơ sở chiết artemisinin ở Việt Nam đều dùng xăng công nghệ hoặc n-hexan làm dung môi chiết. Để tăng độ tan của artemisinin trong dung môi chiết có thể thêm vào vài phần trăm aceton, cồn ethylic hay cloroform vào xăng công nghệ hoặc n-hexan. Tuy nhiên cần chú ý là khi làm như vậy độ tan của artemisinin tăng lên đáng kể nhưng dịch chiết sẽ kéo theo nhiều tạp chất khác ảnh hưởng đến giai đoạn tinh chế sau này.
Tinh chế artemisininDịch chiết sau khi rút ra được cất thu hồi dung môi đến khi khối lượng còn 1/20 hoặc 1/30 dược liệu đem chiết. Cặn còn lại có thể được tinh chế bằng 2 phương pháp sau:
– Phương pháp 1: Chiết artemisinin trong cặn còn lại sau khi cất thu hồi dung môi bằng cồn 500 nóng, cồn 500 nóng chỉ hoà tan artemisinin mà không hoà tan sáp (tạp chất chính có trong phần cặn sau khi cất thu hồi dung môi). Để nguội artemisinin sẽ kết tinh, kết tinh lại trong cồn 960.
– Phương pháp 2: Phần dung dịch cô đặc được để kết tinh trong 24 giờ.
Gạn phần nước cái, phần đặc gồm chủ yếu là sáp và tinh thể artemisinin. Loại sáp bằng nhiệt và xăng nóng ta sẽ thu được artemisinin thô. Hoà tan trong cồn 960, tẩy màu bằng than hoạt, để nguội kết tinh artemisinin, sấy ở nhiệt độ 70-800C.
1.3.3. Phương pháp chiết xuất artemisinin được sử dụng ở Việt Nam
Lá THHV được phơi khô, xay thô và nạp vào nồi chiết. Có thể sử dụng dung môi chiết là xăng công nghiệp hoặc n- hexan. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 5/1, chiết ở nhiệt độ 30-500C, thời gian chiết 3 giờ. Chiết 3 lần, dịch chiết lần 1 và 2 đem cô thu hồi dung môi, dịch chiết lần 3 sử dụng làm dung môi chiết lần 1 mẻ khác. Dịch chiết 1 cô đến khi lượng dịch cô đặc tương với lượng dược liệu đem chiết. Dịch chiết 2 cô đến khi lượng dịch cô đặc bằng 1/5 lượng dịch cô đặc của dịch chiết 1. Dịch cô đặc rút ra được để kết tinh ít nhất 24 giờ, artemisininsẽ kết tinh lẫn với sáp. Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng nhiệt độ và xăng nóng thu được artemisinin thô không lẫn sáp. Có thể kiểm tra đã loại sáp hết bằng cách hoà tan artemisinin thô trong aceton, nếu dung dịch trong là đã loại hết sáp. Artemisinin thô đã loại hết sáp được hoà tan trong cồn sôi, thêm than hoạt và đun sôi 20 phút với sinh hàn hồi lưu, lọc nóng loại than hoạt và để kết tinh ở nhiệt độ thường tối thiểu 24 giờ. Vẩy ly tâm, rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 800C.