Sắc ký phân bố ngược dòng

Trong sắc ký cột cổ điển và MPLC, pha tĩnh sử dụng thường là các chất hấp phụ pha thuận tương đối rẻ tiền và thường chỉ sử dụng một lần. Các pha tĩnh này thích hợp với các chất từ kém phân cực tới phân cực trung bình. Trong những trường hợp phân tích các hỗn hợp phức tạp, các chất phân cực mạnh như glycosid có mạch đường dài, các polyphenol, các alcol, acid phân tử nhỏ v.v… pha tĩnh hấp phụ thường không cho kết quả tốt. Khi ấy, người ta thường sử dụng cơ chế phân bố để tách các chất. Các pha tĩnh phân bố sử dụng trong HPLC (thường là pha đảo) rất thích hợp trong những trường hợp này. Tuy nhiên, các pha tĩnh này thường đăt tiền, chỉ sử dụng trong sắc ký điều chế khi thật cần thiết. Để cải thiện khả năng phân tách các chất phân cực, người ta phát triển phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng (Countercurent chromatography, CCC).

Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng. Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu. Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp có khả năng tách các chất phân cực hiệu quả, hệ dung môi dùng cho cả pha tĩnh và pha động linh hoạt, rẻ tiền và có thể tiến hành trên phân tích lượng mẫu khá lớn trong thời gian tương đối ngắn.

Khác với HPLC hay các kỹ thuật sắc ký cột trên pha tĩnh lỏng mà trong đó pha tĩnh thường được giữ trên một giá mang rắn, pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng là một chất lỏng theo đúng nghĩa. Hai chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng không đồng tan này ‘dịch chuyển’ ngược chiều và tiếp xúc liên tục với nhau. Trong quá trình dịch chuyển, các chất trong hỗn hợp mẫu cần phân tích sẽ được hòa tan một cách cạnh tranh vào pha tĩnh và pha động. Mức độ hòa tan của chất giữa 2 pha phụ thuộc vào hệ phân bố của nó tronng 2 pha. Các chất có hệ số phân bố khác nhau sẽ phân bố vào pha động và pha tĩnh với những tỉ lệ khác nhau và trong quá trình dịch chuyển của pha động sẽ dần dần tách ra khỏi nhau.

Trong quá trình pha động dịch chuyển, sự phân bố các chất giữa 2 pha diễn ra, các chất trong hỗn hợp mẫu ( đuợc đưa vào ở 1 đầu của pha tĩnh) sẽ dịch chuyển dần về cuối pha tĩnh và tách ra khỏi nhau. Các chất có hệ số phân bố trong pha động lớn sẽ tách ra trước trong pha động và đi ra khỏi hệ thống trước tiên. Chất có hệ số k càng lớn sẽ ra càng sớm. Các chất có hệ số phân bố trong pha tĩnh lớn hơn cũng được tách ra khỏi nhau và dịch chuyển trong pha tĩnh về phía cuối cột. Đến một thời điểm nào đó, khi các chất tan nhiều trong pha động đã được tách ra khỏi hệ thống, người ta ngừng không đưa pha động vào nữa mà dùng pha tĩnh để đẩy phần chất lỏng trong hệ thống ra. Các chất đã tách ra trong pha tĩnh cũng sẽ được hứng thành từng phân đoạn riêng biệt. Các chất tách trong hệ càng tôt khi “số đĩa lý thuyết” của hệ càng lớn, tức là khi sự tiếp xúc giữa 2 dung môi và chiều dài của “cột” (pha tĩnh) càng lớn.

Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký phân bố ngược dòng thường là hỗn hợp của 2 hay nhiều (thường không quá 4)dung môi có khả năng hòa tan hạn chế vào nhau. Khi tỉ lệ các dung môi này vượt quá giới hạn hòa tan, chúng sẽ tách thành 2 pha với tỉ lệ của các dung môi trong mỗi pha hoàn toàn khác nhau. Hai pha này sẽ được sử dụng làm pha động và pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng. Ví dụ, với hỗn hợp hai dung môi là n-butanol và nước ở 300C, khi tỉ lệ hai dung môi vượt quá khả năng hòa tan vào nhau sẽ tách thành hai lớp chất lỏng riêng biệt là n-butanol bão hòa nước (với lượng nước là 7% kl/kl) và nước bão hòa n-butanol (với lượng n-butanol ~ 21% kl/kl).

Để một hỗn hợp chất lỏng có thể “đứng yên” làm pha tĩnh, người ta cần có những thiết bị đặc biệt. Thiết bị tách phân bố đơn giản nhất được sử dụng tách các hỗn hợp chất là thiết bị Phân bố ngược dòng (Countercurrent distribution – CCD) được L. C. Craig thiết kế vào những năm 1940. Thiết bị gồm nhiều bộ phận là những ống bằng thủy tinh có thiết kế đặc biệt để chứa pha tĩnh và pha động, khi vận hành có thể chuyển pha động từ ống này sang ống khác. Mỗi ống chiết đuợc xem như một đĩa lý thuyết. Nhược điểm của thiết bị này là số đĩa không nhiều nên khả năng tách tương đối hạn chế và thiết bị tương đối cồng kềnh. Ngày nay, có một số thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng với số đĩa lý thuyết lớn hơn, gọn và dễ sử dụng hơn đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm.

Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ (Droplet countercurrent chromatography – DCCC) được Yoichiro Ito và cộng sự giới thiệu vào những năm 1970. DCCC sử dụng những ống nhỏ có đường kính trong 2 -4 mm và chiều dài 40cm. Các ống này (khoảng 300 ống) được xếp đứng song song với nhau và nối với nhau qua hệ thống ống teflon với đầu ống này nối vào cuối ống kia. Pha động được dịch chuyển qua pha tĩnh dưới dạng những hạt nhỏ nổi lên hay chìm xuống trong pha tĩnh (tùy thuộc vào pha động nặng hơn hay nhẹ hơn pha tĩnh). Nhược điểm của DCCC là tốc độ chậm và hiệu quả tách chưa cao do sự tiếp xúa kém giữa 2 pha.

Sắc ký phân bố ly tâm (Centrifugal partition chromatography –CPC) hay còn gọi là Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ ly tâm (Centrifugal droplet countercurrent chromatography – CDCCC) cũng tương tự như DCCC nhưng dòng pha động có thể được bơm vào với tốc độ cao hơn ( có thể tới 100 lần so với DCCC) nhờ tác động của lực ly tâm. Thiết bị gồm các ống polymer chịu dung môi (như teflon) nối với nhau giống như DCCC nhưng được sắp xếp theo hướng từ tâm ra ngoài của 1 trục quay. Khi vận hành, các ống được quay quanh trục và lực ly tâm sẽ giữ chop ha tĩnh trong ống. Pha tĩnh được bơm vào hệ thống theo hướng từ tâm ra ngoài với pha động nặng hơn hay ngược lại với pha tĩnh nhẹ hơn. Do khả năng tiếp xúc giữa 2 dung môi tốt hơn nên CDCCC có số đĩa lý

thuyết lớn hơn. Tốc độ phân tách của CPC cũng nhanh hơn so với DCCC.

Hệ thống sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography – HSCCC) là hệ thống được Y. Ito phát triển vào những năm 1980 và được sử dụng nhiều hiện nay trong các thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng do hiệu quả phân bố cao và tốc độ phân tách nhanh. Cũng giống như DCCC, HSCCC sử dụng lực ly tâm để giữ một chất lỏng trong hệ thống làm pha tĩnh và chất lỏng còn lại được bơm vào hệ thống làm pha động. Thiết bị HSCCC bao gồm 1 ống nhựa teflon với 1 đầu của ống được dùng làm đầu vào còn đầu kia là đầu ra của hệ thống. Đầu vào và đầu ra của hệ thống có thể đảo ngược tùy theo pha động là nặng hay nhẹ hơn so với pha tĩnh. Ống này được cuộn xoắn lại theo kiểu lò xo hay xoắn ốc, vừa có thể quay quanh trục của nó đồng thời được sắp xếp để có thể quay quanh 1 trục chung theo kiểu chuyển động của hành tinh quanh mặt trời. Tùy theo thiết kế mà thiết bị có số lượng cuộn và cách sắp đặt các cuộn có khác nhau. Trong đó, loại thiết bị có cách sắp xếp các cuộn xoắn theo ‘kiểu J’ phổ biến và được sử dụng nhiều nhất.

Trong phân lập các chất trong dược liệu, để việc phân lập hiệu quả hơn, đặc biệt là với các hỗn hợp phức tạp và có cấu trúc gần giống nhau, người ta thường sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký với các cơ chế tách khác nhau. Ví dụ, như phân tách cao chiết thành các phân đoạn đơn giản hơn bằng các phương pháp sắc ký cột cải tiến (FC, VLC) sau đó tách bằng sắc ký cột cổ điển với các loại pha tĩnh khác nhau, sắc ký rây phân tử, MPLC và HPLC điều chế. Việc áp dụng các phương pháp nên đi dần từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương tiện, pha tĩnh rẻ tiền tới các loại có giá thành cao.