Kỹ thuật trích thủ bệnh phẩm tìm Mycobacterium Leprae

TRỰC KHUẨN HANSEN

Được Armauer Hansen tìm thấy năm 1873, nhưng với công trình của Neisser 1879, Brocq 1885, Lenoir 1886 và nhất là của Besnier 1887 Mycobacterium leprae mới được công nhận là nguyên nhân gây ra bệnh Phong.

Mycobacterium leprae là một loại trực khuẩn kháng acide-cồn, ký sinh nội bào, hình que hoặc hơi cong.

Với phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen, trực khuẩn có hình dạng chắc, dạng đứt khúc hay dạng hạt. Trực khuẩn có thể đứng đơn độc, từng đám hay từng bó gọi là globus (globi).

Hiện nay áp dụng kỹ thuật rạch da để thực hiện phiến phết da tìm vi khuẩn kháng acide – cồn.

ĐỐI TƯỢNG

Chọn lựa bệnh nhân làm phiến phết như sau:

Tất cả các trường hợp bệnh nghi ngờ;

Tất cả các bệnh nhân mới được chẩn đoán lâm sàng cho bất cứ thể bệnh nào;

Tất cả các bệnh nhân đang điều trị;

Tất cả các bệnh nhân hoàn thành điều trị, đang trong thời gian giám sát.

Tất cả bệnh nhân nghi ngờ tái phát, do không điều trị đều hoặc do kháng thuốc;

Tần suất

Bệnh nhân đang điều trị: Lúc bắt đầu điều trị và lúc hoàn thành điều trị đặc hiệu

Bệnh nhân đang giám sát: Chỉ thực hiện đối với MB, mỗi năm ít nhất một lần trong suốt thời gian giám sát (5 năm).

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ

Găng tay, cồn, gạc/gòn thấm nước, băng keo.

Lam kính sạch, tốt nhất là lam mới, và hộp đựng lam.

Bút ghi trên kính: Bằng đầu kim cương hoặc bút lông, hoặc giấy dán, nhãn.

Dao mổ (số 15) và cán dao mổ (số 3).

Đèn cồn.

Phiếu xét nghiệm.

Đặt tất cả những dụng cụ cần thiết trên mặt bàn sạch. Để sẵn phiếu xét nghiệm và bút ghi trên kính.

LỰA CHỌN VỊ TRÍ

Nên lấy bệnh phẩm chỉ ở 2 vị trí:

Một ở dái tai.

Một ở thương tổn. Chọn thương tổn có vẻ hoạt tính mạnh nhất nhưng không chọn ở mặt. (“Hoạt tính” có nghĩa là nổi cộm lên và hơi đỏ).

Lấy bệnh phẩm ở vùng hoạt tính mạnh nhất của thương tổn (thường ở rìa).

Nếu không thấy có thương tổn da nào phù hớp, lấy bệnh phẩm thứ hai từ dái tai khác hoặc ở vị trí thương tổn ghi nhận ban đầu hoặc ở vị trí của phiến phết dương tính trước đó.

Nhiều chương trình kinh điển đã lấy bệnh phẩm từ 4-6 vị trí nhưng ngày nay 2 vị trí được xem như thỏa đáng trong hầu hết các trường hợp.

CÁCH THỰC HIỆN PHIÊN PHẾT DA

Để bệnh nhân ngồi hay nằm tùy vị trí trích thủ, giải thích cho bệnh nhân việc cần làm. Đảm bảo là bệnh nhân xoay lưng lại với dụng cụ.

Rửa tay và mang găng (1)

Dùng một lam kính mới, sạch, không trầy sướt.

Dùng bút ghi trên kính, ghi tên họ hoặc mã sei bệnh nhân (MS) ở vị trí về một phía của tấm lam (2); chép mã số này vào phiếu xét nghiệm.

Sát khuẩn vùng da thương tổn bằng gòn có tẩm cồn. Để khô.

Đốt đèn cồn.

Gắn lưỡi dao mới vào cán dao, bảo đảm giữ cho lưỡi dao không đụng vào bất cứ vật gì.

Kẹp chặt vùng da giữa ngón cái và ngón trỏ, giữ áp lực để đẩy máu đi.

Rạch một đường da khoảng 5mm chiều dài và 2mm chiều sâu (3). Kẹp chặt vùng da để chắc chắn vùng da bị cắt sẽ không có máu. Nếu thấy chảy máu, lau sạch máu bằng bông gòn.

Quay cán dao 90° và giữ ở vị trí thẳng góc với đường cắt. Nạo mặt trong đường cắt 1 hay 2 lần bằng cạnh của lưỡi dao để lấy dịch mô và chất bột nhão. Không nên lây lẫn máu trong bệnh phẩm vì có thể gây trở ngại khi nhuộm và đọc.

Ngưng kẹp da và lau sạch máu với bông gòn.

• Phết bệnh phẩm lên lam kính, trên cùng mặt với mã số (MS). Trải đều bệnh phẩm với mặt phẳng của lưỡi dao làm thành vòng tròn d = 8mm (4).

Lau dao mổ với bông gòn tẩm cồn. Đưa lưỡi dao qua ngọn đèn 3^ị lần. Để nguội mà không chạm vào bất cứ vật gì.

Làm lại như trên với vị trí thứ hai. Dàn bệnh phẩm mà không chạm vào phết bệnh phẩm thứ nhất.

Vứt bỏ lưỡi dao một cách an toàn.

Băng vết thương và cám ơn bệnh nhân.

Để lam kính khô 15 phút ở nhiệt độ phòng xét nghiệm nhưng không để trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời.

Cố định bệnh phẩm bằng cách đưa qua từ từ ngọn đèn cồn với mặt bệnh phẩm hướng lên trên, 3 lần (5). Chỉ hơ lam kính vừa nóng đến mức vẫn còn sờ tay vào được.

Đặt lam kính trong hộp đựng lam và gửi tới phòng xét nghiệm kèm theo phiếu xét nghiệm.

CÁCH NHUỘM PHIẾN PHẾT DA

Áp dụng kỹ thuật nhuộm nóng Zieh-Neelsen. Nhuộm với dd carbol íuchsin 1%, mọi thứ sẽ bắt màu đỏ. Tầy màu với dd acid-cồn 1%, sẽ tẩy màu tất cả ngoại trừ M. leprae. Nhuộm lại với dd xanh methylen 0,2%. Trực khuẩn Phong sẽ bắt màu đỏ trên nền màu xanh.

Dung cu:

Một chai cho mỗi thứ:

• dd carbol fuchsin 1 %
• dd acid-cồn 1%
• dd xanh methylen 0,2%
• đèn cồn, bồn nước, ống hút, que nhuộm, giá đựng lame, giấy thấm, găng tay.

Vô số xét nghiệm các lam kính.

Đặt lam kính lên que nhuộm với mặt có phiến phết hướng lên trên. Có thể nhuộm cùng lúc 10 tấm lame. Đảm bảo các lam không dính vào nhau.

Nhuộm

Trước khi nhuộm, lọc dd carbol fuchsin 1% qua giấy lọc thông thường.

Phủ toàn bộ lam với dd carbol íuchsin 1% (1).

Hơ nhẹ tấm lam qua ngọn đèn cồn đặt ở phía dưới cho tới khi xuất hiện làn khói từ dd car- bol íuchsin (2). Lập lại 3 lần trong 5 phút. Đảm bảo thuốc nhuộm không sôi. Nếu thuốc nhuộm khô đổ thêm hóa chất và hơ nóng lại.

Rửa nhẹ dưới vòi nước (3). Rửa nước cho tới khi giọt nước cuối không còn màu mặc dù bệnh phẩm sẽ còn đỏ đậm.

Tẩy màu

Phủ dd acid-cồn 1% 10 phút (4). Một phương pháp thay thế là phủ với dd acid sulphuric 5% trong 10 phút

Rửa nhẹ dưới vòi nước (5).

Nhuộm tương phản

Phủ dd xanh methylen 0,2% trong 1 phút (6).

Rửa nước (7), để khô trên một giá gỗ nghiêng với mặt bệnh phẩm hướng xuống dưới.

Lam kính đã sẵn sàng để đọc.

CÁCH ĐỌC PHIẾN PHẾT DA

Đặt lam kính dưới kính hiển vi vơi mặt thị kính có phiến phết hướng lên trên và mã số ở bên trái.

Dùng vật kính lOx để tìm trọng tâm ảnh.

Nhỏ 1 giọt dầu soi kính lên phiến phết.

Xoay vật kính lOOx. Có thể sẽ chạm vô giọt dầu (nếu cần di chuyển ốc điều chỉnh để vật kính dầu vừa đủ đụng giọt dầu).

Mở hoàn toàn chắn sáng và nâng tụ quang lên tối đa.

Điều chỉnh vật cho rõ với ốc vi cấp.

Quan sát sự hiện diện của vi khuẩn kháng acid. Chúng là những hình que màu đỏ trên nền màu xanh dương. Vi khuẩn có thể thẳng hay cong và màu đỏ có thể đồng nhất (vi khuẩn chắc) hoặc không đều (đứt khúc hay dạng hạt). Những đám vi khuẩn gọi là globi (bó). Vi khuẩn chắc được xem như còn sống, có thể tìm thấy trong trường hợp bệnh mới, trường hợp bệnh không điều trị hay trường hợp bệnh tái phát.

Sau khi quan sát quang trường đầu tiên, di chuyển sang quang trường kế tiếp. Quan sát khoảng 100 quang trường cho mỗi phiến phết.

Nếu có vi khuẩn, xác định số lượng theo thang chỉ số vi khuẩn (BI) dưới đây. Tính chỉ số BI riêng cho mỗi bệnh phẩm. Ghi kết quả cả hai phiến phết vào sổ xét nghiệm.

Rửa lam trong xylen, không được chùi.

Lưu trữ lam trong hộp đựng lam để kiểm tra chất lượng.

Những lam không lưu trữ nên bỏ đi hoặc khử trùng, đun sôi và rửa lại để tái sử dụng trong các xét nghiệm phân và nước tiểu. Không dùng lại với xét nghiệm da hay thử đàm.

Gửi kết quả tới Bác sĩ đã yêu cầu xét nghiệm.

Ghi chú: Ghi nhận chỉ số BI cho cả hai phiến phết trên tấm lam. Đối với bệnh nhân có phiến phết dương tính, chỉ số BI trung bình hay chỉ số BI cao nhất sẽ được coi là chỉ số BI của bệnh nhân đó.

CÁCH PHA CHẾ THUỐC NHUỘM

Vật dụng cần thiết để pha chế hóa chất

• Bột Basic Fuchsin                                          Nước rửa
• Ethyl alcohol 95% (*)                                     ống đong chia vạch 1000ml
• Tinh thể Phenol                                             Hai ống chích 10 ml
• Acid hydrochloric (HCl)                                Ba chai màu 1 lít
• Bột xanh Methylen                                        Cân

(*) Nếu không có methyl alcohol hay alcohol biến chất có thể dùng thay thế.

Pha chế :

Các hướng dẫn này dùng để pha 1 lít. Nếu cần pha ít hơn 1 lít, tính lại số lượng thành phần cho phù hợp. Pha chế hóa chất mới mỗi tháng.

Có thể bảo quản hóa chất trong chai lớn đậm màu. Để dùng trong ngày, chiết hóa chất sang một chai để nhuộm như là một chai nhỏ giọt 250ml.

• Dung dịch Carbol Fuchsin 1%

Bước 1: Pha 100ml dung dịch Fuchsin bão hòa:

Thêm 10g bột Basic Fuchsin trong 100ml của Ethyl Alcohol 95%.

Khuây cho đều.

Bước 2: Pha dung dịch nhuộm Carbol Fuchsin 1%:

Bỏ 50g tinh thể Phenol vào lọ.

Đặt lọ vào bồn nước ấm cho đến khi tinh thể Phenol hóa lỏng.

Đổ 50ml Phenol lỏng vào ống đong chia vạch 1000ml.

Thêm nước cho đủ 900ml.

Thêm 100ml dung dịch Fuchsin balo hòa cho đủ 1000ml và trộn đều.

Bảo quản trong chai đậm màu. cần lọc trước khi dùng hoặc đổ lên lam kính qua một cái phễu nhỏ với tấm giấy lọc.

Acid-cồn 1%

Đổ 1000ml Ethyl Alcohol 95% vào ống đong 1 lít.

Dùng ống chích 10 ml rút bỏ đi 10 ml cồn.

Đổ một lượng nhỏ Acid hydrochloric (HCl) vào một chén nhỏ.

LƯU ỷ: Đây là hóa chất ăn da và độc. Không đụng vào và không được hít.

Rút 10ml HC1 bằng ống chích 10ml khô.

Bỏ từ từ HC1 trong vô cồn. Không bao giờ thêm cồn vào acid.

Trút lượng acid còn dư ở chén vô chai đựng acid.

Đổ dung dịch Acid-cồn từ ống đong vào một chai lớn đậm màu. Có thể thay thế Acid- cồn 1% bằng dung dịch 5% acid sulphuric (H2S04).

Dùng 950ml nước cất. Từ từ cho thêm vào 50ml Acid Sulphruric đậm đặc. Không bao giờ thêm nước vào acid. Bảo quản trong chai đậm màu.

• Dung dịch Xanh Methylen 0,2%

Thêm 2g bột Xanh Methylen vào 1 lít nước cất. Trộn cho tan đều.

Bảo quản trong chai đậm màu, thường xuyên lọc.