7. Kiểm nghiệm tinh dầu:
7.1. Phương pháp cảm quan
7.2. Xác định các hằng số vật lý:
Tỷ trọng, năng suất quay cực (D), Chỉ số khúc xạ nD, độ tan trong alcol 70, 800…
7.3. Xác định các chỉ số hoá học: chỉ số acid, chỉ số ester, chỉ số acetyl…
7.4. Định tính các thành phần trong tinh dầu:
a. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
– Chất hấp phụ: Silicagen Viện kiểm nghiệm (Bộ y tế, Hà Nội), silicagen G Merck, silicagen HF254 v.v..)
– Dung môi: + Cyclohexan
+ n-Hexan
+ Ether dầu hoả (độ sôi 40-700)
+ Benzen
+ Cloroform v.v..
Để tách các thành phần hydrocarbon terpenic, không có chứa oxy thường dùng các dung môi đơn độc, ít phân cực. Để tách các thành phần có chứa oxy thường dùng các hỗn hợp dung môi. Ví dụ:
+ Benzen – ethyl acetat 95 : 5; 90 : 10
+ Ether dầu hoả – Ether 95 : 5; 90 : 10
+ n-Hexan – ethyl acetat 85 : 15
+ Toluen – ethyl acetat 95 : 5
– Hiện màu:
+ Thuốc thử hiện màu chung: Vanilin/H2SO4, anisaldehyd/ H2SO4, H2SO4 đặc.
+ Thuốc thử hiện màu các nhóm chức: Thuốc thử 2, 4-DNPH (các hợp chất carbonyl), thuốc thử Diazo (các hợp chất phenol).
– Phương pháp định tính:
+ Dựa vào giá trị Rf và màu sắc các vết. So sánh với các giá trị này của chất chuẩn.
+ Phương pháp chấm chồng với chất chuẩn (Co-chromatography).
Việc định tính có thể tiến hành trên sắc ký lớp mỏng 1 chiều hoặc 2 chiều với các tấm kính có kích cỡ khác nhau từ 2,5 x 7,5cm đến 20 x 20cm.
b. Phương pháp sắc ký khí (SKK):
Nguyên tắc của phương pháp SKK là dựa trên sự phân chia của các thành phần trong tinh dầu giữa 2 pha không trộn lẫn vào nhau. Pha cố định là các chất lỏng được tẩm lên trên bề mặt của chất mang (cột nhồi) hoặc tráng thành một lớp phim mỏng trong lòng cột tách (cột mao quản). Pha di động là các chất khí: H2, He, Ar, N2…
Phương pháp định tính:
+ Dựa vào giá trị thời gian lưu Rt. So sánh với thời gian lưu của chất chuẩn. Thời gian lưu của một cấu tử là thời gian chất đó được lưu lại trong cột tách, được tính từ khi bơm vào máy đến khi xuất hiện ở detector, được tính bằng phút.
Phương pháp này có thể gây nhầm lẫn, vì có nhiều thành phần khác nhau có cùng một thời gian lưu như nhau. Vì vậy phải tiến hành so sánh trên nhiều cột tách có tính chất khác nhau (phân cực và không phân cực).
+ Phương pháp phân tích cộng: Trộn chất cần so sánh vào tinh dầu, và tiến hành chạy sắc ký. So sánh 2 bản sắc ký đồ (SKĐ), đỉnh của chất dự kiến sẽ được tăng lên nhiều so với bản sắc ký nguyên mẫu.
+ Phương pháp phân tích trừ: Loại chất cần định tính bằng các phương pháp hoá học. So sánh 2 bản SKĐ tinh dầu nguyên bản và tinh dầu đã loại chất cần định tính. Ở bản sắc ký đồ thứ 2, đỉnh đó sẽ bị mất đi hoặc còn lại rất nhỏ. Phương pháp này có thể áp dụng để định tính các thành phần phenol hoặc aldehyd hay ceton.
+ Phương pháp chuyển dịch đỉnh: Tạo các dẫn chất mới bằng các phản ứng hoá học với chất dự kiến định tính. So sánh 2 bản sắc ký. Ở bản sắc ký thứ 2, đỉnh chất dự kiến định tính sẽ mất đi (hoặc còn lại rất nhỏ), trong khi đó lại xuất hiện một đỉnh mới. Phương pháp này hay áp dụng để xác định các thành phần alcol, so sánh với sản phẩm sau khi ester hoá.
+ Kết hợp giữa SKK và các phương pháp phân tích phổ: SKK và phổ khối (MS), SKK và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phương pháp SKK kết hợp với khối phổ (GC/MS) hiện nay được áp dụng phổ biến để phân tích định tính và định lượng tinh dầu. Độ chính xác của phương pháp phụ thuộc vào số lượng phổ mẫu trong thư viện của máy đi kèm theo. Tuy nhiên kết quả phân tích cũng có thể nhầm lẫn. Vì vậy người ta khuyên là nên phân tích ít nhân trên hai cột tách có đọ phân cực khác nhau. Ngoài ra yếu tố kinh nghiệm của người phân tích kết quả cũng rất quan trọng.
c. Phương pháp hoá học:
Thông thường là tạo các dẫn chất kết tinh bằng các phản ứng hoá học. Đo độ chảy của các dẫn chất này và đối chiếu với tài liệu.
d. Phương pháp phân tích phổ
Tách riêng từng cấu tử bằng các phương pháp sắc ký cột, SKLM chế hoá, các phương pháp hoá học và dùng các phương pháp phân tích phổ để giải thích cấu trúc.
7.5. Định lượng các thành phần chính trong tinh dầu:
Ngoài phương pháp định lượng bằng SKK, nói chung các Dược điển đều qui định các phương pháp vật lý, hóa lý và hoá học có thể áp dụng để định lượng các thành phần chính trong tinh dầu. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên các phản ứng đặc hiệu của các nhóm chức. Các nhóm chức có thể là:
a. Alcol:
Alcol toàn phần:
Phương pháp thông thường được ghi trong Dược điển của nhiều nước là phương pháp acetyl hoá. Quá trình định lượng được tiến hành qua 3 giai đoạn:
– Giai đoạn 1: acetyl hoá alcol bằng lượng dư anhydrid acetic:
Rửa bỏ phần acid thừa, làm khô tinh dầu.
– Giai đoạn 2: Xà phòng hoá một lượng chính xác tinh dầu đã acetyl hoá bằng một lượng dư dung dịch kiềm chuẩn (NaOH 0,5N hoặc KOH 0,5N trong ethanol)
– Giai đoạn 3: Định lượng dung dịch kiềm chuẩn dư bằng một dung dịch acid chuẩn có nồng độ tương đương. Từ lượng kiềm tiêu thụ trong quá trình xà phòng hoá tính ra được hàm lượng alcol toàn phần có trong tinh dầu.
Alcol dưới dạng este:
Xà phòng hoá một lượng chính xác tinh dầu bằng lượng kiềm chuẩn và được tiến hành tương tự như “giai đoạn 2 và giai đoạn 3″ ở trên.
Alcol tự do:
Căn cứ vào hàm lượng alcol toàn phần và alcol este sẽ tính được lượng alcol tự do có trong tinh dầu.
Một số Dược điển đã giới thiệu phương pháp định lượng alcol tự do như sau :
Cân chính xác một lượng tinh dầu (G) g và acetyl hoá bằng một lượng thừa anhydrid acetic. Định lượng anhydrid acetic thừa bằng một dung dịch kiềm chuẩn (V2)ml. Song song tiến hành với mẫu trắng (V1)ml. Hàm lượng alcol tự do được tính theo công thức:
Hàm lượng % alcol = (V1 – V2). M x 100
G
M là đương lượng gam tương ứng của alcol với 1ml dung dịch kiềm chuẩn.
Một số điều cần lưu ý:
– Với alcol bậc 1 và 2 việc acetyl hoá dễ dàng, chỉ cần chất xúc tác là natri acetat khan, thời gian đun 2 giờ trên bếp cách cát, cách dầu, bếp điện hay ngọn lửa gas.
– Với alcol bậc 3 việc acetyl hoá lâu hơn, tác nhân acetyl hoá là acetyl clorid với sự có mặt dimethyl alanin.
– Đối với tinh dầu sả Citronella (Citronella oil), nếu định lượng geraniol bằng phương pháp acetyl hoá thì không chỉ geraniol và các alcol bậc 1 khác phản ứng, mà cả citronelal cũng tác dụng với anhydrid acetic, đóng vòng và tạo dẫn xuất isopulegyl acetat. Vì vậy cụm từ “geraniol toàn phần” trong tinh dầu sả Citronella là bao gồm cả hàm lượng geraniol và citronelal.
b. Aldehyd và ceton:
– Phương pháp tạo sản phẩm bisulfitic: Có 2 con đường dẫn đến sản phẩm bisulfitic:
Trong trường hợp thứ 2, phải trung hoà lượng NaOH bằng acid (thường dùng acid acetic) thì phản ứng mới xảy ra hoàn toàn. Phản ứng này hay dùng trong định lượng các hợp chất carbonyl có dây nối đôi ở vị trí – so với nhóm carbonyl, ví dụ citral, aldehyd cinnamic.
Sản phẩm bisulfitic là chất kết tinh, có thể tách ra khỏi phần tinh dầu không tham gia phản ứng, vì vậy có thể áp dụng phương pháp cân hoặc dùng bình cassia để định lượng.
– Phương pháp dùng hydroxylamin hydroclorid:
Cơ chế phản ứng:
Định lượng acid hydroclorid giải phóng ra bằng dung dịch kiềm chuẩn, từ đó tính ra được hàm lượng carbonyl có trong tinh dầu.
– Phương pháp tác dụng với 2,4-dinitrophenyl hydrazin (2,4-DNPH):
Các hợp chất carbonyl tác dụng với 2,4-DNPH tạo thành dẫn chất hydrazon tủa màu đỏ da cam. Có thể dùng phương pháp cân hoặc phương pháp đo quang để định lượng.
c. Các hợp chất oxyd – cineol
– Phương pháp xác định điểm đông đặc:
Ở nhiệt độ rất thấp, cineol có thể kết tinh, nhiệt độ kết tinh tỷ lệ thuận với hàm lượng cineol. Ví dụ hàm lượng cineol là 72% có điểm đông đặc ở – 140C, 82% ở – 80C và 85% ở -60C. Người ta đã thiết lập 1 đồ thị nêu lên sự liên quan giữa nhiệt độ đông đặc và hàm lượng cineol trong tinh dầu. Tuy nhiên phương pháp ít được áp dụng, và tinh dầu phải có hàm lượng cineol > 64%.
– Phương pháp Orto – cresol:
Cineol kết hợp với orto-cresol tạo thành một sản phẩm kết tinh, có nhiệt độ kết tinh tỷ lệ thuận với hàm lượng cineol trong tinh dầu. Ví dụ nhiệt độ kết tinh là 240C hàm lượng cineol là 45,6%, ở 400C là 66,8% ở 550C là 99,3% v. v.. Đo nhiệt độ kết tinh của hỗn hợp và đối chiếu với tài liệu, sẽ biết được hàm lượng cineol trong tinh dầu.
– Phương pháp Resorcin:
Cineol kết hợp với dung dịch resorcin bão hoà, tạo thành sản phẩm kết tinh. Dùng bình cassia để đọc tinh dầu không tham gia phản ứng, từ đó tính được lượng cineol trong tinh dầu.
– Phương pháp Acid phosphoric:
Cineol kết hợp với acid phosphoric đặc (tỷ trọng 1,750) tạo thành sản phẩm kết tinh (C10H18O.H3PO4). Làm sạch sản phẩm rồi cân, hoặc cho vào bình cassia, giải phóng cineol bằng nước nóng, và đọc lượng cineol ở trên phần chia vạch ở cổ bình.
d. Các hợp chất peroxyd – ascaridol:
Phương pháp thông dụng nhất là dựa vào tính chất oxy hoá của các hợp chất perosxyd: Trong môi trường acid, ascaridol oxy hoá kali iodid giải phóng iod tự do. Iod giải phóng ra được định lượng bằng dung dịch natri thiosulfat chuẩn.
Ngoài ra còn có thể áp dụng các phương pháp vật lý khác như cực phổ, phổ tử ngoại để định lượng.
e. Các hợp chất phenol:
Phương pháp định lượng thông dụng nhất dựa trên nguyên tắc: phenol tác dụng với kiềm, tạo sản phẩm phenolat:
ArOH + NaOH -> ArONa + H2O
Các hợp chất phenolat tan trong nước, vì vậy có thể dùng bình cassia để định lượng. Hoặc áp dụng phương pháp cân: Tách riêng phần tan trong nước, dùng acid để giải phóng phenol. Tách riêng phenol bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, cân.
Ngoài ra có thể áp dụng các phương pháp đo quang. Ví dụ đối với thymol và carvacrol có thể dùng 4-aminoantypyrin để tạo màu.
Ngoài những ví dụ đã nêu ở trên, có thể áp dụng các phương pháp vật lý, hóa lý khác: Phương pháp đo độ đông (định lượng anethol trong tinh dầu hồi), phương pháp phổ tử ngoại (để định lượng các hợp chất ether phenolic), phương pháp SKK v.v..
7.6. Phát hiện tạp chất và chất giả mạo:
Tạp chất thường gặp trong tinh dầu là nước và các ion kim loại nặng. Sự có mặt những yếu tố này là do kỹ thuật cất không đảm bảo tiêu chuẩn, thường hay gặp trong tinh dầu mua của các cơ sở sản xuất tinh dầu tư nhân. Tuy lượng không nhiều, nhưng đó là các tác nhân thúc đẩy quá trình oxy hoá, làm cho tinh dầu chóng bị hỏng.
Các chất giả mạo được đưa vào trong tinh dầu là do cố ý để làm giảm giá thành.Việc giả mạo là cả một nghệ thuật hết sức tinh vi, tuy vậy sự có mặt các hợp chất này thường làm thay đổi các chỉ số lý, hoá của tinh dầu như độ tan, tỷ trọng, năng xuất quay cực v.v.. Có thể dựa vào các đặc tính này để phát hiện ra chất giả mạo.
a. Phát hiện các tạp chất:
* Tìm nước:
Lắc tinh dầu với CaCl2 khan hoặc CuSO4, khan nếu có nước CaCl2 sẽ chảy hoặc CuSO4 sẽ chuyển từ màu xanh nhạt sang xanh nước biển.
* Tìm ion kim loại nặng:
Lắc tinh dầu với nước, tách riêng lớp nước, rồi cho sục một luồng khí H2 S, nếu có ion kim loại nặng sẽ có tủa sulfur mầu đen.
b. Phát hiện các chất giả mạo:
Chất giả mạo có thể là các hợp chất tan trong nước hoặc tan trong dầu.
1. Các hợp chất tan trong nước: Ethanol và glycerin.
* Ethanol và glycerin rất hay được cho vào trong tinh dầu có thành phần chính là alcol, ví dụ như tinh dầu bạc hà. Phương pháp xác định chung là: lắc với nước, nếu có thể tích giảm chứng tỏ có sự giả mạo. Dụng cụ xác định có thể dùng bình cassia hoặc loại ống đong có nút mài.
* Có thể định tính ethanol bằng các phương pháp sau:
+ Tạo sản phẩm iodoform có mùi đặc biệt.
+ Giỏ từng giọt nước vào trong một ống nghiệm có chứa khoảng 5ml tinh dầu. Lắc, nếu có ethanol tinh dầu sẽ đục như sữa.
* Định tính glycerin: Bốc hơi tinh dầu trên nồi cách thuỷ, cho vào cắn một ít tinh thể kali sulfat, đun trực tiếp. Sẽ có mùi đặc trưng của acrolein.
Phản ứng này cũng áp dụng để xác định sự có mặt của dầu béo trong tinh dầu.
2. Các chất giả mạo tan trong dầu:
* Dầu mỡ
– Giỏ 1 giọt tinh dầu lẫn giấy bọc hay giấy bóng kính mơ hay giấy pơluya (pelure). Hơ nhanh trên bếp điện cho tinh dầu bay hơi mà giấy không bị cháy, nếu để lại vết là có dầu mỡ.
Tuy nhiên một số tinh dầu có chứa các thành phần các hợp chất sesquuiterpen, một số bị hoá nhựa, khi hơ vẫn để lại vết, nên cần có những phương pháp kiểm nghiệm khác.
– Bốc hơi tinh dầu trên nồi cách thuỷ, xác định chỉ số xà phòng của cắn hoặc làm phản ứng để tạo ra acrolein như ở mục xác định glycerin.
* Dầu hoả, xăng, dầu parafin:
Những thành phần này không tan trong alcol, có thể kiểm tra độ tan của tinh dầu trong ethanol 800.
Trong một ống đong dung tích 100ml, cho vào 80ml ethanol 800. Giỏ từng giọt tinh dầu cho đến hết 5ml. Tinh dầu sẽ tan hết trong alcol, còn chất giả mạo sẽ nổi lên trên bề mặt. Phương pháp này có thể xác định được chất giả mạo ở tỷ lệ 5%.
* Tinh dầu thông:
Cách phát hiện dễ dàng nhất là dùng SKK. Thành phần chính của tinh dầu thông là – và –pinen hoặc -caren, sẽ xuất hiện ngay ở phần đầu của sắc ký đồ. Cũng có thể phát hiện bằng SKLM: – và -pinen sẽ xuất hiện ở tiền tuyến, khi khai triển với các hệ dung môi thông thường.
Có thể dựa vào đặc tính là tinh dầu thông không tan trong ethanol 700: cho 2ml tinh dầu vào ống nghiệm, nhỏ từng giọt ethanol 700. Nếu có tinh dầu thông sẽ có hiện tượng đục.
Phương pháp này có thể phát hiện sự giả mạo tinh dầu thông trong tinh dầu bạc hà ở tỷ lệ 5%.
https://hoibacsy.vn
Ngô Văn Thu (2011), “Bài giảng dược liệu”, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội
Phạm Thanh Kỳ và cs. (1998), “Bài giảng dược liệu”, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội
Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học
Viện dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, tập I, Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật.
Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.