5. Điện di mao quản
Điện di là một phương pháp phân tích dựa trên sự khác nhau về độ linh động điện đi (linh độ điện di, electrophoretic mobility, m) của hai hay nhiều chất hay tiểu phân tĩnh điện trong điện trường.
Khi một dung dịch các chất được đặt trong một điện trường, các chất phân ly thành ion hay có khả năng tạo các tiểu phân tĩnh điện sẽ dịch chuyển về phía điện cực trái dấu với nó. Tốc độ dịch chuyển của các ion trong hệ thống phụ thuộc vào độ lớn của điện trường, bản chất của chất phân tích và một số yếu tố khác của môi trường phân tích. Trong cùng một hệ, tốc độ dịch chuyển của các chất phụ thuộc vào độ linh động điện di của chất đó. Các chất có điện tích và/hoặc hình dạng và kích thước phân tử khác nhau sẽ dịch chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường và tách khỏi nhau trong hệ điện di.
Có 2 phương thức điện di chính là điện di trên mặt phẳng và điện di mao quản. Điện di trên mặt phẳng là phương pháp điện di được áp dụng sớm nhất. Bản điện di là một mặt phẳng được trắng bởi 1 lớp gel (tinh bột, agar, agarose hay polacrilamid), một lớp giấy lọc hay 1 bản mỏng trải silicagel, cellulose, cellulose acetat, nitrocellulose. Tất cả được tẩm dung dịch đệm. Lớp gel, giấy hay silicagel… chỉ làm nhiệm vụ giá mang để giữ dung dịch đệm là môi trường để cho các ion dịch chuyển. Mẫu thử được đưa lên lớp gel. Hai cực của một điện trường mạnh tạo bởi dòng điện một chiều được áp trên 2 đầu đối diện của lớp gel làm các chất dịch chuyển về cực trái dấu tạo nên các băng trên bản điện di. Các băng này có thể được phát hiện bằng màu sắc trong ánh sáng thường, trong ánh sáng tử ngoại hay dùng các thuốc thử tạo màu hay tạo thành các chất phát huỳnh quang. Do hiệu ứng sinh nhiệt Joule, điện thế áp dụng trong điện di trên mặt phẳng thường chỉ trong khoảng 15 – 40 V/cm để tránh sự tăng nhiệt quá mức làm khô dung dịch đệm trên bản điện di. Có nhiều kỹ thuật khác nhau được sử dụng trong điện di trên mặt phẳng.
Sơ đồ thiết bị điện di mao quản
Trong điện di mao quản (Electrophoresis, CE), các chất được phân tách trong một mao quản silica nung chảy được chứa đầy dung dịch điện giải. Đường kính trong của mao quản thường từ 20 – 100 mm, chiều dài mao quản thay đổi thường là 20 – 30 cm kể từ đầu vào đến detector. Chiều dài tối đa của mao quản là 100 cm. Hai đầu ống mao quản được nhúng vào 2 cốc đựng dung dịch điện giải. Ở gần một đầu của mao quản được gắn với detector. Hai đầu mao quản được nối với hai cực của nguồn điện một chiều (có thể thay đổi điện thế được) có điện thế thường vào khoảng 5 – 30 KV (có thể tới 800 V/cm). Điện thế càng lớn các chất dịch chuyển càng nhanh nhưng có thể không kịp tách ra khỏi nhau. Thay đổi điện thế có thể đạt được việc phân tách tốt trong thời gian ngắn nhất.
Trong CE, tất cả các ion đều dịch chuyển về phía cực âm (cathod) mặc dù lực điện di làm các ion dương và âm dịch chuyển ngược chiều nhau. Hiện tượng này là do dòng điện thẩm (electroosmotic flow, EOF) sinh ra trong dung dịch đệm trong lòng mao quản silica nung chảy. Dòng điện thẩm này dịch chuyển về cathod với tốc độ có thể tới 2 mm/s và phụ thuộc vào pH, độ nhớt của môi trường… và thường lớn hơn tốc độ dịch chuyển của các ion theo linh độ điện di. Như vậy, các ion dương sẽ dịch chuyển nhanh hơn tốc độ điện di vốn có của nó, các chất trung tính sẽ dịch chuyển vào tốc độ của dòng điện thẩm còn các ion âm sẽ dịch chuyển chậm hơn và ngược chiều với chiều điện di. Các chất khác nhau sẽ tách ra khỏi nhau và dịch chuyển qua detector để được phát hiện và ghi thành điện di đồ.
Các detector sử dụng trong điện di cũng rất phong phú và có độ nhạy cao. Detector thông dụng nhất vẫn là detector tử ngoại. Detector có thể gắn trực tiếp trên mao quản, dùng mao quản như tế bào đo hay dùng các tế bào đo riêng biệt. Nhược điểm của phương pháp đo trực tiếp trên mao quản là độ nhạy thấp do quãng đường ngắn. Các detector huỳnh quang, laser, điện hóa hay dẫn điện… cũng được sử dụng. Việc kết nối máy điện di mao quản với khối phổ kế có những khó khăn nhất định về mặt giao diện. Tuy nhiên các thiết bị CE-MS hiện đã có mặt trên thị trường, tăng khả năng ứng dụng của điện di mao quản. Kỹ thuật ion hóa trong CE-MS chủ yếu là kỹ thuật phun điện (electro spray ionization, ESI).
Trong điện di mao quản, các kỹ thuật điện di sau được sử dụng:
– Điện di vùng (zone electrophoresis) là kỹ thuật đợn giản và được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay trong cả điện di trên mặt phẳng vào mao quản. Trên mao quản, kỹ thuật này được gọi là điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE). Việc thêm vào dung dịch đệm một số chất sẽ cho các kỹ thuật điện di mới như MECK, CIEF, CSE.
– Sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) là một phương pháp điện di trong đó mẫu thử được tách ra bởi sự phân bố khác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm (pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn. Trong phần lớn trường hợp, MEKC được tiên hành trong môi trường kiềm. Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề mặt thường sử dụng nhất.
– Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC. MEEKC sử dụng các vi nhũ tương (thường là dầu/nước) làm pha tĩnh giả. MEEKC linh động và hiệu quả hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ly và trung tính hay trong phân tích quang hoạt. MEEKC được dùng nhiều trong phân tích dược phẩm
– Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): là một kỹ thuật mới được phát triển gần đây sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rửa giải đi qua pha tĩnh của cột nhồi HPLC có dung môi. CEC sử dụng thiết bị điện di thông thường nhưng có thêm ưu điểm là việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng hơn so với điện di mao quản thông thường. Các chất trung tính cũng có thể phân tách với hiệu quả rất cao trong kỹ thuật này.
– Điện di rây mao quản (capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di rây mao quản, dung dịch đệm được thêm vào những chất có tác dụng cản trở vật lý sự di chuyển của các phân tử như polyethylen oxyd hay dextran. Các phân tử lớn như protein sẽ di chuyển chậm hơn do ma sát hay cản trở bởi các chất này. Mức độ bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động của phân tử. Nếu thêm vào môi trường điện di các chất có cấu trúc mạng 3 chiều tương tự như sắc ký lọc gel ta có Điện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE). Tuy nhiên, trong điện di mao quản, CSE cho kết quả lặp lại và tin cậy hơn, dễ thay thế sau khi điện di nên được sử dụng rộng rãi hơn trong phân tích protein.
– Ngoài các kỹ thuật trên, một số kỹ thuật điện di mao quản khác cũng được sử dụng. Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng tốc (isotachophoresis, ITP)…
Điện di mao quản có hiệu lực phân tách rất cao. Một trong những yếu tố quan trọng là các chất được di chuyển đồng đều trong mao quản tạo nên các băng dịch chuyển chứ không phải các vùng dịch chuyển dạng parabol như trong sắc ký lỏng cao áp. Điều này hạn chế sự dãn rộng các băng phân tách, tạo nên các đỉnh hẹp trên điện di đồ làm choh dung lượng peak của điện di cao hơn, đồng nghĩa với độ phân giải cao hơn. Khi chọn được các điều kiện điện di thích hợp, độ phân giải của phương pháp có thể đạt được rất cao. Số đĩa lý thuyết trong một hệ điện di mao quản có thể đạt tới hàng trăm ngàn (thường là 100.000 – 250.000 đĩa lý
thuyết), thậm chí hàng triệu (có thể tới 30.000.000 đĩa lý thuyết trong CGE các oligonucleotid). Do các đỉnh của các chất tách ra hẹp hơn nên chúng có cường độ lớn hơn, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp. Phương pháp điện di nguyên thủy (điện di vùng) vốn chỉ áp dụng cho các chất ion hóa. Vì thế, trong một hỗn hợp phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly di chuyển làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lương. Thiết bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém về vật tư tiêu hao hơn các phương pháp sắc ký khác.
Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc ký khác. Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly. Mặc dù các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hóa nhưng việc phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn tương đối hạn chế. So với sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch đệm, điện thế) cũng hạn chế và ít linh động hơn so với lựa chọn dung môi và pha tĩnh sắc ký.
Kỹ thuật điện di đã được áp dụng vào phân tích các hợp chất tự nhiên (alkaloid, acid amin…) từ khá sớm (giữa những năm 1950) với điện di trên mặt phẳng. Tuy nhiên, do không thuận tiện bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC phát triển sau đó (1970) nên ít được sử dụng. Kỹ thuật này hiện nay chủ yếu được sử dụng trong phân tích các đại phân tử (protein, polysaccarid, vật liệu di truyền…) trong sinh hóa, lâm sàng và các lĩnh vực liên quan.
Từ khi các thiết bị điện di mao quản được thương mại hóa vào năm 1987, với các ưu diểm trong phân tích các phân tử nhỏ, điện di mao quản đã thu hút sự quan tâm của các nhà phân tích hóa hợp các chất tự nhiên. Trong các hợp chất tự nhiên, các hợp chất phenol, alcaloid, các acid, acid amin rất thích hợp với phân tích điện di mao quản về cả định tính và định lượng. Các kỹ thuật điện di thường sử dụng trong phân tích dược liệu là CZE, MEKC và CEC.