Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết

Thăng hoa có thể thực hiện trực tiếp trên dược liệu như tách caffein từ chè hoặc có thể sử dụng để tách và tinh chế các hợp chất có trong dịch chiết thô.

Các thiết bị hiện đại cho phép sử dụng áp suất giảm và kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình thăng hoa.

Cất phân đoạn thường được sử dụng để tách các hợp phần trong một hỗn hợp các chất dễ bay hơi. Trong hóa thực vật nó được sử dụng rộng rãi trong phân lập các hợp phần của tinh dầu. Tuy nhiên khó có thể sử dụng phương pháp này để tách các hợp phần phụ trong hỗn hợp tinh dầu dưới dạng tinh khiết. Để phân lập tinh dầu và acid hydrocyanic và một số alcaloid thể lỏng như spartein, nicotin từ thực vật thường sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước.

Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn hợp. Có thể lấy ví dụ một hỗn hợp muối alcaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa đủ từng phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng base tự do. Tăng dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần. Mỗi lần thêm kiềm vào ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn base. Có thể dùng phương pháp này để tách các acid hữu cơ có thể hoà tan trong dung môi không trộn lẫn nước. Nếu ta có một hỗn hợp muối các acid hữu cơ ta có thể giải phóng phân đoạn các acid đó bằng cách thêm dần các acid vô cơ.

Đây là một phương pháp phân lập đã được sử dụng nhiều trước đây và hiện nay vẫn có giá trị trong việc tách các hỗn hợp khó tách. Phương pháp này sử dụng độ tan khác nhau của một hợp phần của một hỗn hợp cần tách trong một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhất định. Người ta thường sử dụng các dẫn xuất của các hợp phần cần tách để thay đổi độ tan của nó (ví dụ muối picrat của các alcaloid, asazon của đường).

Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ thuật sắc ký là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất. Để tẩy màu và làm trong dung dịch ta sử dụng than hoạt, các tạp chất màu sẽ bị hấp phụ bởi than hoạt và sau khi lọc ta sẽ thu được một dung dịch không màu.

Tất cả các chất rắn khi được phân chia nhỏ đều có khả năng hấp phụ ít nhiều các chất khác trên bề mặt của nó và ngược lại tất cả các chất đều có thể bị hấp phụ từ dung dịch ở các mức độ khác nhau. Hiện tượng hấp phụ chọn lọc là nguyên lý cơ bản của sắc ký. Quá trình cơ bản của sắc ký có thể được mô tả dựa trên thí nghiệm của Tswett như sau:

Dịch chiết ether dầu hoả (40-60OC) của lá cây tươi được cho qua một cột thuỷ tinh thẳng đứng trong có chứa bột calci carbonat. Các sắc tố trong cột bị hấp phụ vào chất nhồi cột và sẽ tách trong quá trình chảy qua cột. Các sắc tố hấp phụ mạnh hơn như xanthophyl và clorophyl sẽ tập trung thành các băng màu đặc trưng rõ rệt gần đỉnh cột trong khi các sắc tố có độ hấp phụ kém hơn như các caroten tập trung ở các băng thấp hơn phía dưới.

Thường việc tách hoàn toàn các thành phần thành các băng rõ rệt không xảy ra ở giai đoạn hấp phụ đầu tiên mà trong giai đoạn này các băng còn tập trung gần nhau ở phần đỉnh cột. Tiếp tục triển khai cột bằng dung môi tinh khiết, các chất bị hấp phụ sẽ di chuyển dần xuống phía dưới và các băng được tách ra xa nhau hơn. Trong nhiều trường hợp quá trình được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng dung môi triển khai khác mà các chất ít bị hấp phụ từ nó hơn. Ví dụ nếu ether dầu hỏa có chứa một ít alcol được cho thẳng qua cột trong thí nghiệm được mô tả ở trên thì các băng sẽ tách ra xa nhau hơn và sẽ chạy qua cột nhanh hơn so với khi chỉ dùng ether-dầu hỏa để triển khai. Khi ta cho dung môi tiếp tục chạy qua cột băng thấp hơn trong cột sẽ chạy tới đáy và biến mất, sắc tố sẽ thu được ở dịch chảy ra ở đáy cột. Quá trình này gọi là quá trình giải hấp phụ (elution), dung dịch đó được gọi là dung dịch giải hấp phụ (eluate). Các chất dễ dàng hấp phụ từ các dung môi không phân cực như ether dầu hỏa, benzen thường dễ dàng giải hấp phụ bằng các dung môi

phân cực như alcol, nước, piridin… Một vài các hợp chất bị hấp phụ ở pH nhất định sẽ được giải hấp phụ ở một pH khác.

Các chất khác nhau thường được dùng làm chất hấp phụ là: nhôm oxyd, silicagel, magnesi oxyd, kaolin, calci carbonat, than hoạt và các loại đường. Sucrose ở dạng bột được Tswett sử dụng để tách các chlorophyl A và B.

Khi ta tiến hành sắc ký các chất không màu, các băng của các chất bị hấp phụ không thể trông thấy được. Trong một số trường hợp có thể sử dụng đèn tử ngoại để xác định các vùng phát quang dưới ánh sáng tử ngoại hoặc có thể chia sắc phổ ra nhiều phần nhỏ riêng biệt và giải hấp phụ hoặc chiết từng phần nhỏ đó riêng rẽ. Đôi khi người ta thu dịch giải hấp phụ của toàn bộ cột thành các phần riêng biệt rồi tiến hành phân tích riêng các phần riêng biệt đó.

Dụng cụ để tiến hành sắc ký hấp phụ rất đơn giản chỉ gồm một cột bằng thuỷ tinh trong nhồi chất hấp phụ.

Sắc ký hấp phụ thường được sử dụng trong phân lập và tinh chế các vitamin, hormon, một số các alcaloid, các glycosid tim, antraquinon…