CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỂ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

A – Dựa trên tính chất tạo bọt: Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút.

Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào chỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là sốml nước để hoà tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện qui định). Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt dưới 100. Nếu ống có cột bọt cao 1 cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau: ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là:

10.1/0,04=250     

    Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1, 2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam.

B – Dựa trên tính chất phá huyết: Đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin không thể hiện rõ tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hồng cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nhau nên người ta cho rằng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết của saponin  người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt, có thể dùng máu của súc vật có sừng khác, hoặc dùng máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm.

    Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một thứ máu đã chọn (tiến hành trong điều kiện qui định). Cách tiến hành:

    Để làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình 1 lít có miệng rộng, dùng đũa quấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh và lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua gạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dùng được vài ngày. Từ máu đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm. Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm bằng cách khác như sau: Lấy 4,5ml máu thỏ trộn với 0,5ml dung dịch 3,65% Natri citrat rồi thêm 220ml dung dịch đệm.

    Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì cứ dùng dung dịch dược liệu ban đầu, nếu ống III và IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung dịch đệm để pha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả 3 ống II, III, IV thì pha loãng gấp 5 (1+4), nếu cả 4 ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1+9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu. Nếu trường hợp ngược lại, nghĩa là cả 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đặc hơn.

    – Thí nghiệm quyết định: Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống phá huyết), đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0,05ml, ống thứ  hai 0,10ml,…, dung dịch đệm theo thứ tư giảm dần: ống thứ nhất 0,95ml, ống thứ hai 0,90ml,…, dung treo máu 2% mỗi ống 1ml. Sau đó lắc khẽ ngay để trộn đều. Sau 30 phút lắc lại 1 lần nữa. Sau 24 giờ thì đọc kết quả: tìm ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó. Chính độ pha loãng của ống này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu. Có thể đọc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau khi đã để yên 2 giờ.

C – Dựa trên độ độc đối với cá: Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin nên người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon). Để đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số cá cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá,…

E – Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (phản ứng Salkowski).

    – Saponin triterpenoid cho tác dụng với vanillin 1 % trong HCl và hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) sẽ có màu hoa cà.

    – Saponin tác dụng với antimoin trichlorid trong dung dịch chloroform rồi soi dưới đèn phân tích tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang xanh còn saponin steroid thì vàng.

    Phản ứng Liebermann-Burchardt cũng hay dùng để phân biệt 2 loại sapogenin: lấy vài miligram sapogenin hoà nóng vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ-xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía.

F – Sắc ký lớp mỏng: Chiết xuất và tinh chế sơ bộ saponin: đối với saponin trung tính và acid có thể tiến hành như sau:  bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo rồi chiết saponin bằng methanol-nước (4:1). Loại methanol dưới áp suất giảm. Hoà cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-butanol, bốc hơi butanol dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để có dung dịch chấm sắc ký. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có khi dùng aceton hoặc hexan thay ether).

    Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi đến khô trên nồi cách thủy. Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 80oC rồi kiềm hoá bằng ammoniac. Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký.

    Sau đây là một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagel-G.

    Cách hiện màu: Dựa vào tính phá huyết bằng cách tráng một lớp gelatin-máu (hoà tan 5 g gelatin trong 100ml dung dịch NaCl 9%o ở 600C, khi nguội đến 400C thì thêm máu bò đã loại fibrin) hoặc phun dung treo máu 2% đã loại fibrin lên bản mỏng.

    Các thuốc thử dùng cho các loại saponin và sapogenin nêu dưới đây sau khi phun cần phải sấy 10 phút ở 1100C rồi quan sát màu ở ánh sánh thường hoặc ánh sáng tử ngoại (365nm): thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hoà trong chloroform), thuốc thử Liebermann-Burchardt (1ml H2SO4 + 20ml anhydrid acetic + 50ml chloroform), thuốc thử Salkowski (dung dịch acid sulfuric 10%-50% trong nước hoặc 5%-10% trong ethanol), acid phosphomolybdic 10% trong ethanol, acid phosphotungstic 20% trong ethanol, dung dịch acid phosphoric 50% trong nước, vanillin sulfuric (vanillin 1% trong cồn tuyệt đối 100ml + acid sulfuric 2ml).

    Saponin nhóm spirostan còn có thể hiện màu bằng thuốc thử  Sannié (dung dịch vanillin 1% trong cồn (a), anhydrid acetic + H2SO4  12:1 (b), phun dung dịch (a) rồi sấy 1200C trong 3 phút sau đó phun dung dịch (b), vết saponin có màu vàng.

    Đối với nhóm spirostan và nhóm steroid alcaloid có thể dùng thuốc thử Carr-Price để phân biệt các dẫn chất có nối đôi và không có nối đôi ở vị trí C-5. Các dẫn chất 5 có màu đỏ ở 200C và tím đỏ sau khi sấy 1050C. Cũng có thể phân biệt 2 loại dẫn chất trên bằng thuốc thử Marquis (0,2ml dung dịch formaldehyd 37% trong nước + 10ml H2SO4), chỉ có loại 5 cho phản ứng.

    Các saponin nhóm spirosolan và solanidan có thể phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff.

    Phương pháp cân. Chiết saponin rồi cân. Cách tiến hành chiết như trình bày ở phần SKLM. Có khi người ta thủy phân saponin, phần sapogenin rất ít tan trong nước được lọc hoặc được hoà tan trong dung môi hữu cơ rồi đem bốc hơi dung môi hữu cơ, sấy, cân.

    Phương pháp đo quang. Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin-sulfuric. Ví dụ định lượng acid glycyrrhetic trong cam thảo, phản ứng cho màu tím.

    Đối với nhóm spirostan, A. Akahori dùng aldehyd có nhân thơm + acid phosphoric để định lượng: 50 g sapogenin + 500 g anis aldehyd trong ethanol 99%, đun 10 phút ở 1000C để yên 1 giờ rồi đo mật độ quang ở 550 nm. Các dẫn chất  5-sapogenin ví dụ diosgenin thì dùng thuốc thử FeCl3-H3PO4: 800mg FeCl3 trong 10ml nước (a), lấy 1ml (a) thêm đủ 50ml với H3PO4 (b). 50 g diosgenin + 50ml (b) làm lạnh 5 phút trong nước đá, thêm 0,5ml H2SO4, làm lạnh 10 phút rồi đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C trong 9 phút. Sau khi làm lạnh 10 phút và để yên 60 phút đem đo ở 485 nm. Phương pháp này có thể dùng định lượng riêng biệt các sapogenin sau khi tách bằng sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng.

H – Xác định bằng quang phổ: Các sapogenin triterpenoid trong H2SO4 đậm đặc có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng tử ngoại ở 310 nm. Cực đại này không thể hiện với các saponin steroid.

    Phổ hồng ngoại của các sapogenin steroid đặc biệt có 4 pic đặc trưng của mạch nhánh spiroacetal: pic thứ nhất ở 850 – 857 cm-1 đối với các chất 25 S hoặc 860 – 866 cm-1 đối với các chất 25 R. Pic thứ hai ở gần 900 (894-905), pic thứ ba ở gần 915 (915-923), pic thứ tư ở gần 980 (980-987). Để phân biệt sapogenin thuộc 25 R hoặc 25 S thì căn cứ vào cường độ hấp thu của pic thứ hai và pic thứ ba: các chất 25 R thì pic thứ hai có cường độ hấp thụ mạnh hơn pic thứ ba; đối với 25 S thì ngược lại.

TÀI LIỆU THAM KHẢO