Sắc ký lỏng cao áp

Trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC), để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký, người ta sử dụng chất nhồi cột với kích thước rất nhỏ, thường dưới 10 μm với đường kính của các xoang xốp bên trong các hạt từ 80 – 120 Å cho phân tích các phân tử  nhỏ và 300 Å dùng cho phân tích các đại phân tử. Do kích thước hạt rất nhỏ, để dung môi có thể chảy qua với tốc độ dòng tối ưu (khoảng 1ml/phút với cột có đường kính trong 4,6 mm được nhồi pha tĩnh có kích thước 3,7 μm), người ta phải dùng bơm nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng dung môi qua cột. Vì thế nên phương pháp được gọi là sắc ký lỏng cao áp.

Các loại cột HPLC phân tích thông dụng hiện nay sử dụng các hạt nhồi có kích thước 3,7 μm. Gần đây, các hạt nhồi có kích thước hạt 1,7 μm đã được sử dụng.

Cột sắc ký loại này có hiệu năng tách cao hơn so với loại cột chứa hạt nhồi 3,7 μm nhưng cũng phải dùng áp suất cao hơn rất nhiều (tới 1000 atm) để bơm dung môi. Các máy sắc ký sử dụng áp suất cao này được gọi là sắc ký lỏng siêu cao áp (ultra high pressure liquid chromatography, UHPLC, hay còn được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu năng, Ultra (high) performance liquid chromatography, U(H)PLC)1. Khi áp lực bơm tăng lên cao sẽ ảnh hưởng tới cấu trúc pha tĩnh cũng như các vấn đề về thiết bị. Người ta cũng cải tiến hình dạng và bề mặt pha tĩnh để giảm bớt áp suất bơm dung môi. Một số cột có các pha tĩnh như vậy cũng đã có trên thị trường như cột đơn khối (monolithic) hay các hạt có cấu trúc xốp ở bề mặt nhưng đặc ở tâm… hoặc được tăng cường thêm lực chịu nén của các hạt pha tĩnh.

Các loại cột dùng cho sắc ký điều chế các chất có thể sử dụng các hạt nhồi có kích thước hạt tương tự như cột phân tích, nhưng thường được nhồi với các hạt có kích thước hơi lớn hơn (5 μm) để làm giảm áp suất bơm dung môi.

Kích thước cột sắc ký phân tích cũng thay đổi theo hiệu năng tách và nhu cầu phân tích. Đường kính trong của cột phân tích thay đổi từ 0,05 – 5 mm, thông dụng hiện nay là 4,6 mm; 3,0 mm hay 2,1 mm. Các cột dùng với mục đích điều chế có đường kính trong lớn hơn từ 7 mm với cột bán điều chế tới 100 mm hay hơn. Chiều dài cột thay đổi từ 30 -300 mm.

Pha tĩnh sử dụng trong HPLC rất phong phú và đa dạng. Các cơ chế tách như phân bố, hấp phụ, rây phân tử, trao đổi ion… đều được sử dụng. Tuy nhiên, các pha tĩnh thông dụng nhất là pha tĩnh phân bố (pha đảo hay pha thuận). Các hạt nhồi của loại pha tĩnh này thường có một nhân (giá mang) là Silica gel với các nhóm OH silanol trên bề mặt được liên kết với một chất khác đóng vai trò là pha tĩnh thực sự. Loại hạt nhồi này thường được gọi là pha liên kết (bonded phase). Thông dụng nhất là các loại pha tĩnh RP – 18, RP – 8 với pha tĩnh tương ứng là một mạch hydrocarbon có 18 hay 8 carbon. Các pha tĩnh khác ít được sử dụng hơn.

Dung môi (pha động) dùng trong HPLC (pha đảo) thông dụng nhất là hỗn hợp nước – methanol hoặc nước – acetonitril với các tỉ lệ khác nhau. Để tăng khả năng phân giải các chất có khả năng phân ly, các dung dịch đệm với pH khác nhau hay các acid (acid trifluoroacetic, acetic, formic) hay các chất kềm hữu cơ có thể được thêm vào pha động. Với các pha tĩnh sắc ký khác, đặc biệt là sắc ký hấp phụ, có thể sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau.

Có khá nhiều loại detector được sử dụng trong việc phát hiện các chất tách ra khỏi cột sắc ký lỏng cao áp. Các detector phát hiện sự thay đổi các đặc tính của dung dịch rửa giải như detector chỉ số khúc xạ (reflective index, RI), detector điện hóa (electrochemical detector), detector tán xạ bay hơi (evaporating light scattering detector, ELSD), detector UV-Vis đơn bước song (UV detector) hay detector huỳnh quang (fluorescence detector) cho biết có các chất ra khỏi cột vào những thời điểm nhất định. Các detector quang phổ như detector dãy diod quang (photodiode array, PDA), khối phổ (MS) hay cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ngoài việc cho biết các chất ra khỏi cột thời gian trên sắc ký đồ truyền thống còn cho biết thêm nhưng thông tin quan trọng khác về chất được tách ra, đó là phổ của các chất. Các thông tin này rất có ích và tăng độ tin cậy của việc nhận định các chất, so sánh với chất chuẩn. Phần lớn các detector sử dụng trong HPLC không phá hủy các chất (ngoại trừ MS). Các hệ thống sắc ký hiện đại có thể ghép nối tiếp hay song song nhiều detector với nhau để có thêm thông tin xác định các chất.

Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau. Tuy hiệu năng tách của sắc ký lỏng cao áp không cao bằng sắc ký khí nhưng khả năng phân tích của nó rộng hơn nhiều. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.

Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, sắc ký cao ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt.

Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp. Với

sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguốn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… So với sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu năng tách cao hơn nên cho các kết quả điểm chỉ chi tiết và nhiều giá trị hơn. Khi kết hợp với các thiết bị quang phổ hiện đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị trong việc xác định các chất. Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-NMR-CD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.

Một ứng dụng khác của sắc ký lỏng cao áp là phân lập các chất tinh khiết (HPLC điều chế). Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý của HPLC phân tích. Điểm khác biệt duy nhất là hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh khiết. Theo truyền thống, các cột có đường kính trong lớn hơn 4,7mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột chế điều chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm. Trong quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có đường kính trong tới 100 cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC.