Định tính glycosid tim trong lá Trúc đào (Nerium oleander L., Apocynaceae)

Cân khoảng 10g lá Trúc đào khô đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.

Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng.

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu  xanh lá.

– Phản ứng Baljet

Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.

– Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.

Chú ý: Các phản ứng của vòng lacton cho màu sắc không bền nên cần quan sát màu ngay sau khi nhỏ thuốc thử.

– Phản ứng Keller – Kiliani

Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ.

Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.

– Phản ứng Xanthydrol

Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml thuốc thử Xanthydrol. Đun ống nghiệm trong nồi cách thuỷ sôi 3 phút, sẽ xuất hiện màu đỏ.

– Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim ở trên 2 giọt CHCl3 – EtOH (1 : 1), lắc nhẹ để hòa tan cắn được dịch chấm sắc ký.

Lấy 1mg tinh thể Neriolin chuẩn hòa tan trong 0,5ml CHCl3 – EtOH (1 : 1), lắc

nhẹ được dung dịch Neriolin chuẩn để chấm sắc ký.

– Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm để chấm sắc ký.

Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký và dung dịch Neriolin chuẩn lên bản mỏng silicagel kích thước 2 x 10cm.

– Hệ dung môi khai triển: CHCl3 – n-BuOH (9 : 0,5)

– Bình sắc ký đã được bão hòa dung môi khai triển.

Sau khi khai triển sắc ký, quan sát các vết bằng thuốc thử Kedde. Các glycosid tim nhóm cardenolid cho các vết màu hồng hoặc xanh tím.

Kết quả: Sắc ký đồ dịch chiết cắn glycosid tim từ lá Trúc đào phải có vết tương ứng với vết Neriolin chuẩn với Rf = 0,75, có màu xanh tím với thuốc thử Kedde.

Thuốc thử Kedde: Lấy 5ml dung dịch 3,5 – dinitrobenzoic acid 3% trong ethanol và 5ml dung dịch NaOH 2M, trộn đều. Dung dịch pha xong dung ngay.