TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG GLYCOSID TIM

Glycosid tim là những chất kết tinh, không mầu, vị đắng, có năng suất quay cực, tan trong nước, cồn, không tan trong benzen, ether.

Glycosid tim có đường 2-desoxy sẽ rất dễ bị thủy phân khi đun với acid vô cơ 0,05N trong methanol 30 phút, trong khi những glycosid khác trong điều kiện đó khó bị thủy phân.

Glycosid tim dễ bị thủy phân bởi các enzym. Các enzym, thường có sẵn trong cây, có khả năng cắt các đơn vị đường cuối mạch (xa aglycon) thường là glucose để chuyển thành các glycosid thứ cấp như enzym digilanidase trong lá Digitalis lanata, digipurpidase trong lá Digitalis purpurea, strophanthobiase trong hạt Strophanthus courmontii, scillarenase trong Urginea maritima.

Vòng lacton 5 cạnh hay 6 cạnh dễ bị mở bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành dẫn chất iso không tác dụng. Dưới đây là cơ chế tạo thành dẫn chất iso của nhóm cardenolid.

Các thuốc thử định tính cũng như để định lượng chủ yếu dựa trên các thuốc thử tạo mầu ở ánh sáng thường hoặc tạo huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím.

Trước khi tiến hành các phản ứng, người ta loại tạp chất trong nguyên liệu bằng ether dầu hỏa hoặc hexan, sau đó chiết bằng cồn, pha loãng độ cồn rồi lại loại tạp tiếp bằng dung dịch chì acetat 15%, lọc, dịch lọc được lắc với chloroform hoặc hỗn hợp chloroform-ethanol (4:1). Bốc hơi dịch chiết rồi hòa glycosid trong dung môi thích hợp để tiến hành phản ứng.

Các thuốc thử có thể chia làm 2 loại: loại thuốc thử phản ứng với đường 2,6 desoxy và loại thuốc thử phản ứng với aglycon.

Phản ứng kém nhạy với đường 2,6-dexosy đã acetyl hóa và âm tính với đường 2,6-desoxy đã nối với glucose ở vị trí 4. Do đó trong digitoxin thì cả 3 đơn vị digitoxose của mạch đường đều phản ứng với xanthydrol, trong lúc đó purpureaglycosid A chỉ có 2 đơn vị digitoxose phản ứng vì đơn vị thứ ba đã nối với glucose. Các đường 2,6-desoxy âm tính với thuốc thử.

Thực hiện: Lấy khoảng 20-200 μg glycosid cho vào ống nghiệm khô, thêm 5ml thuốc thử rồi trộn đều, đậy nút bông, đặt trên nồi cách thủy sôi 3 phút sau đó làm lạnh bằng cách ngâm 5 phút vào nước đá và để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Đọc trên quang phổ kế ở bước sóng 550 nm. Nếu định tính thì không cần làm lạnh.

10-20 μg đường 2,6-dexosy hoặc một lượng glycosid có lượng đường tương đương được hòa trong 1 ml aceton. Thêm 5 ml acid phosphoric đậm đặc (d=1,70) trộn đều, nhúng vào nước nóng 15 phút, làm nguội. Dung dịch có mầu vàng được đo bằng quang phổ kế ở λ 474 nm.

Thuốc thử được pha làm 2 dung dịch:

– Dung dịch 1 gồm 100 ml acid acetic đậm đặc trộn với 1 ml dung dịch FeCl3 5%.

– Dung dịch 2 gồm 100 ml acid sulfuric đậm đặc trộn với 1 ml dung dịch FeCl3 5%.

Hòa tan 5 mg glycosid vào dung dịch 1 rồi cho thêm dung dịch 2. Mặt ngăn cách có mầu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần sẽ thấy lớp trên có mầu xanh từ dưới khuếch tán lên. Độ nhạy của phản ứng kém thuốc thử xanthydrol. Mầu không ổn định nên ít dùng để định lượng.

Cần chú ý thuốc thử Keller-Kiliani và xanthydrol cũng dương tính với các digitanol glycosid (glycosid có trong Digitalis không phải glycosid tim nhưng có phần đường 2,6-desoxy).

Các thuốc thử này có thể phân làm 2 nhóm: nhóm thuốc thử phản ứng lên nhân steroid và nhóm phản ứng lên vòng lacton.

Thuốc thử Liebermann-Burchardt: Phản ứng này không những chỉ lên mầu với glycosid tim mà còn lên mầu với nhiều dẫn chất có nhân steroid khác.

Thực hiện theo Stoll: chất thử cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt acid acetic sau đó thêm vài ml hỗn hợp gồm 50 phần anhydrid acetic và phần acid sulfuric, trộn đều, mầu thay đổi từ hồng đến xanh lá.

Thực hiện theo Brieskorn: một ít chất thử (10 ml) hòa tan trong chloroform, thêm 2 ml hỗn hợp thuốc thử (gồm 1 ml H2SO4 đậm đặc và 20 ml anhydrid acetic). Tùy theo glycosid mà mầu thay đổi từ đỏ đến hồng dần dần đến xanh lá, xanh chàm.



Các tác nhân dehydrat hóa làm mất nước tạo huỳnh quang do hình thành nối đôi ở vị trí 14 (15); đối với cardenolid có OH ở C-16 thì thêm nối đôi vị trí 16 (17) tạo thành hệ nối đôi liên hợp vói vòng butenolic nên huỳnh quang càng mạnh hơn.

Acid phosphoric (phản ứng Pesez-Jensen): phản ứng này rất nhạy (mức μg), cho huỳnh quang xanh ve. Nếu thực hiện với glycosid có đường 2-desoxy mầu vàng của thuốc thử trên phần đường có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng. Có thể khắc phục bằng cách thêm hydrazin hydrat, chất này sẽ gắn vào nhóm aldehyd của đường.

Thuốc thử Tattje: Thuốc thử gồm 62,5g acid phosphoric 85%, 37,5 g H2SO4 đđ. và 0,05 g FeCl3.6H2O. Thuốc thử này cho phản ứng với các cardenolid có OH ở C-16 (kể cả trường hợp đã bị ester hóa) mầu đỏ đậm sau khi đun 5 phút ở 1000 C. Mầu bền trong 2 giờ. Đối với các dẫn chất không có nhóm OH này thì mầu kém khoảng 100 lần so với chất tương ứng. Nếu định lượng, đọc ở bước sóng 271 nm.

Thuốc thử Svendsen-Jensen: dung dịch acid trichloracetic 25% trong cồn 95% hoặc CHCl3 dùng phun để phát hiện khi tiến hành sắc ký. Các cardenolid có OH ở C-16 cho huỳnh quang xanh (độ nhạy ở mức μg).

Các glycosid và aglycon thuộc nhóm cardenolid khi cho tác dụng với những dẫn chất nitro thơm ở môi trường kiềm sẽ tạo nên những sản phẩm có mầu đỏ đến tím. Phản ứng phụ thuộc vào nhóm methylen hoạt động của vòng butenolic.

Baljet nghiên cứu oxy hóa digitoxigenin bằng acid picric (2,4,6-trinitro phenol) trong môi trường kiềm thấy có mầu đỏ da cam, sau đó thấy các glycosid tim khác cũng có mầu. Mầu tương đối bền nên dùng cả định tính lẫn định lượng. Phản ứng được giải thích do sự tạo thành phức anion có mầu:

Thuốc thử: hòa tan 0,100 g acid picric trong 25 ml ethanol 90% thêm một hỗn hợp gồm 5 ml NaOH 15% và 70 ml nước cho đủ 50 ml, trộn đều, khi dùng mới pha.

Thuốc thử là dung dịch 3,5-dinitro benzoic acid 2% trong ethanol. Chất thử được hòa tan trong ethanol, thêm thuốc thử rồi thêm dung dịch NaOH, phản ứng có mầu đỏ tía. Nếu định lượng, đọc ở bước sóng 540 nm.

Thuốc thử là m-dinitrobenzen 1% trong  cồn tuyệt đối, cũng thực hiện trong môi trường kiềm. Phản ứng có mầu tím, mầu không bền nên cũng cản trở việc định lượng.

Ngoài những thuốc thử nitro thơm nói trên, người ta còn dùng một số thuốc thử nitro thơm khác như 2,4-dinitronaphatalen (thuốc thử Frère Jacque); 2,2’,4,4’-tetranitro diphenyl; 2,4-dinitrophenyl sulfon; 3,5-dinitroaisol.. cũng thực hiện trong môi trường kềm.

Các chất thuộc nhóm cardenolid khi hòa tan vào pyridin rồi thêm dung dịch natri nitroprussiat 0,3 – 0,5% sau đó thêm vào dung dịch NaOH 10 – 15% để đảm bảo môi trường kiềm sẽ xuất hiện mầu đỏ.

Chú ý rằng các thuốc thử nitro thơm nói trên và thuốc thử Legal âm tính với các dẫn chất thuộc nhóm bufadienolid. Muốn phát hiện nhóm này có thể dùng thuốc thử SbCl3 trong chloroform sẽ có mầu tím sau khi đun nóng. Tốt nhất là dựa vào quang phổ tử ngoại. Ngoài ra một số hợp chất tuy không thuộc nhóm cardenolid nhưng có nhóm methylen hoạt động đứng cạnh nhóm carbonyl cũng dương tính với các thuốc thử thuộc nhóm nitro thơm và thuốc thử Legal nói trên ví dụ như chất neoandrographolid, thujon, benzalceton…

Để xác định đối chiếu hoặc tách từng chất để nghiên cứu ta có thể thực hiện sắc ký lớp mỏng, dùng chất hấp phụ là silicagel G.

Sau đây là một vài hệ dung môi: ethylacetat-methanol-nước (80:5:5), chloroform-pyridin (60:10), chloroform-methanol (98:2), butanol-acid acetic-nước (100:4:24) hay (100:10:30), ethyl acetat-pyridin-nước (5:1:4), dichloromethan-methanol-formamid (80:19:1).

Để hiện mầu các dẫn chất nhóm cardenolid, có thể dùng một số thuốc thử đã nói ở phần trên, hay dùng là thuốc Kedde (mầu đỏ tía), thuốc thử Raymond-Marthoud (mầu tím). Các dẫn chất có đường 2-desoxy thì dùng thuốc thử xanthydrol.

Trong vùng tử ngoại, nhóm cardenolid có đỉnh hấp thu cực đại 215-218 nm và log ε khoảng 4,1; nếu trong phân tử có thêm nhóm carbonyl (ví dụ strophanthidin) thì có đỉnh hoặc vai ở 272 -305 nm, còn các dẫn chất bufadienolid có đỉnh hấp thu cực đại ở khoảng 300 nm log ε khoảng 3,7.

Trong vùng hồng ngoại, nhóm bufadienolid do có vòng coumarin (pyran-2-on) nên có các đỉnh hấp thu ở 1730 cm-1 và 2 đỉnh ở 1640 và 1540 cm-1.

Để định lượng nhóm cardenoid, người ta dựa vào các phản ứng cho mầu hoặc huỳnh quang đã nói ở trên.

Có thể định lượng trực tiếp trên dịch chiết toàn phần đã loại tạp hoặc sau khi tách các cardenolid chính trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng. Tiếp theo, khi đánh giá các vết bằng máy đo mật độ quang trực tiếp trên sắc đồ hoặc hòa tan cardenolid ứng với các vết, làm phản ứng mầu rồi đo mật độ quang. Có thể định lượng bằng phương pháp phổ huỳnh quang, phương pháp này có độ nhạy cao. Cũng có khi người ta định lượng các genin sau khi thủy phân bằng cách đun sôi với HCl 0,2 N, chiết bằng ether hoặc chloroform, bốc hơi dung môi rồi tiến hành làm phản ứng mầu hoặc huỳnh quang.

Phương pháp đo quang dựa trên phản ứng của glycosid tim với acid picric (thuốc thử Baljet), dinitrobenzen-NaOH (thuốc thử Raymond – Marthoud) cũng được sử dụng để định lượng glycosid tim toàn phần sau khi tinh chế dịch chiết dược liệu. [BP 2009]

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp cũng được sử dụng trong glycosid tim. Pha tĩnh thường sử dụng là RP-18, glycosid tim được phát hiện bằng detector UV ở 220 nm.

Trong nhiều trường hợp, kết quả của phương pháp định lượng bằng hóa học nêu ở trên không ăn khớp với liều tác dụng nên Dược điển các nước và Dược điển Việt Nam qui định đánh giá hiệu lực của glycosid tim bằng phương pháp sinh vật. Súc vật hay dùng là mèo hoặc ếch. Đối với mèo chúng ta căn cứ vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm trương, đối với ếch căn cứ vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm thu.

Đối với ếch, dung dịch thử được tiêm theo đường dưới da vào túi bạch huyết, đối với mèo tiêm vào tĩnh mạch đùi, sau đó tính ra đơn vị ếch hoặc đơn vị mèo.

Đơn vị ếch (Đ.V.Ê) là liều tối thiểu của dược liệu hay glycosid tim làm cho đa số ếch trong 1 lô ếch thí nghiệm bị ngừng tim. Thí nghiệm tiến hành trong những điều kiện quy định.

Đơn vị mèo (Đ.V.M) là liều tối thiểu của dược liệu hay glycosid tim làm cho tim mèo ngừng đập, tính theo 1kg thể trọng. Thí nghiệm tiến hành trong những điều kiện quy định.

Cần chú ý rằng mỗi loài động vật chịu đựng với các liều độc rất khác nhau. Liều độc với thỏ gấp 2 lần mèo còn đối với chuột cống thì gấp 60 lần. Ếch rất nhạy cảm với glycosid tim, khác với cóc. Người ta còn thấy rằng mèo và chó cùng chịu đựng một liều như nhau đối với cao chiết từ hạt S. kombe nhưng digitoxin tác dụng trên chó yếu hơn trên mèo.

Những dược liệu chứa glycosid tim sau khi đã ổn định, làm khô và để nơi khô ráo cũng chỉ có giá trị sử dụng trong 1 năm. Những dạng bào chế có độ ẩm tối đa 3,5% đựng trong bao bì hàn kín có thể bảo quản tới 5 năm.